腺脫氨酶（EC：3.5.4.4 腺苷 deaminase ADA）是嘌呤核苷代謝中重要的酶類，屬于基酶，每分子至少含2個(gè)活性巰基，其活性能對(duì)氯汞甲酸完全抑制。ADA能催化腺嘌呤核苷轉(zhuǎn)變?yōu)榇吸S嘌呤核苷，再經(jīng)核苷磷酸化酶作用生成次黃嘌呤，其代謝緩和終產(chǎn)物為尿酸。
簡介
腺苷脫氨酶（也稱為腺苷氨基水解酶，或N-（2-乙酰氨基）-亞氨基二醋酸）是參與嘌呤代謝的酶（EC3.5.4.4）。它需要從食物中分解腺苷和組織中核酸的轉(zhuǎn)換。它在人體中的主要功能是免疫系統(tǒng)的發(fā)育和維持。然而，ADA的完整生理作用尚未完全了解。
結(jié)構(gòu)
ADA以小形式（作為單體）和大形式（作為二聚體 - 配位化合物）存在。在單體形式中，酶是多肽鏈，折疊成8股平行的α/β桶，其圍繞作為活性位點(diǎn)的中央深口袋。除8個(gè)中心β-桶和8個(gè)外周α-螺旋外，ADA還含有5個(gè)額外的螺旋：殘基19-76倍折成三個(gè)螺旋，位于β1和α1折疊之間；兩個(gè)反平行的羧基末端尾旋位于β-桶的氨基末端。
ADA活性位點(diǎn)含有鋅離子，鋅離子位于活性位點(diǎn)的最深凹陷處，由來自His15，His17，His214，Asp295和底物的五個(gè)原子配位。鋅是活動(dòng)所必需的唯 一輔助因子。
底物腺苷被穩(wěn)定并通過9個(gè)氫鍵與活性位點(diǎn)結(jié)合。與基質(zhì)嘌呤環(huán)大致共面的Glu217的羧基在適當(dāng)位置與基質(zhì)的N1形成氫鍵。Asp296的羧基也與底物嘌呤環(huán)共面，與底物的N7形成氫鍵。Gly184的NH基團(tuán)處于與底物的N3形成氫鍵的位置。Asp296與Zn形成鍵離子以及底物的6-OH。His238也與底物6-OH形成氫鍵。底物核糖的3'-OH與Asp19形成氫鍵，而5'-OH與His17形成氫鍵。在活性位點(diǎn)的開口處，通過基質(zhì)的2'-OH和3'-OH，在水分子上形成另外兩個(gè)氫鍵。
由于酶內(nèi)活性位點(diǎn)的凹陷，基質(zhì)一旦結(jié)合，幾乎完全與溶劑隔離。當(dāng)結(jié)合時(shí)，基材對(duì)溶劑的表面暴露是自由狀態(tài)下基材的表面暴露的0.5%。
反應(yīng)
N-（2-乙酰氨基）-亞氨基二醋酸不可逆地使腺苷脫氨基，通過用氨基取代基將其轉(zhuǎn)化為相關(guān)的核苷肌苷。
然后肌苷可被另一種稱為嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）的酶衍生化（從核糖中除去），將其轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤。
催化機(jī)理
所提出的ADA催化脫氨作用機(jī)理是通過四面體中間體進(jìn)行立體特異性加成 - 消除。通過任何一種機(jī)制，作為強(qiáng)親電試劑的Zn激活水分子，水分子被堿性Asp295去質(zhì)子化以形成攻擊性氫氧化物。His238定向水分子并穩(wěn)定攻擊氫氧化物的電荷。將Glu217質(zhì)子化以將質(zhì)子提供給底物的N1。
由于鋅，Asp295和His238殘基的位置，反應(yīng)是立體特異性的，其全部面向底物的嘌呤環(huán)的B側(cè)。
已經(jīng)觀察到對(duì)ADA的競(jìng)爭性抑制，其中產(chǎn)物肌苷作用于競(jìng)爭性抑制劑對(duì)酶活性起作用。
功能
ADA被認(rèn)為是嘌呤代謝的關(guān)鍵酶之一。該酶已在細(xì)菌，植物，無脊椎動(dòng)物，脊椎動(dòng)物和哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，具有高度的氨基酸序列保守性。高度的氨基酸序列保守性表明N-（2-乙酰氨基）-亞氨基二醋酸在嘌呤補(bǔ)救途徑中的關(guān)鍵性質(zhì)。
首先，人類的ADA參與免疫系統(tǒng)的發(fā)育和維持。然而，還觀察到ADA關(guān)聯(lián)與上皮細(xì)胞分化，神經(jīng)傳遞和妊娠維持有關(guān)。還提出，除腺苷分解外，ADA還刺激應(yīng)激性氨基酸的釋放，并且是A1腺苷受體和異源三聚體G蛋白偶聯(lián)所必需的。腺苷脫氨酶缺乏會(huì)導(dǎo)致肺纖維化，表明長期暴露于高水平的腺苷可以加劇炎癥反應(yīng)而不是抑制它們。還已經(jīng)認(rèn)識(shí)到腺苷脫氨酶蛋白和活性在過表達(dá)HIF-1α的小鼠心臟中上調(diào)，這部分地解釋了在缺血應(yīng)激期間表達(dá)HIF-1α的心臟中腺苷的減弱水平。
病理學(xué)
腺苷脫氨酶基因中的一些突變導(dǎo)致它不被表達(dá)。由此產(chǎn)生的缺陷是嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病（SCID）的一個(gè)原因，特別是常染色體隱性遺傳。ADA水平不足也與肺部炎癥，胸腺細(xì)胞死亡和T細(xì)胞受體信號(hào)缺陷有關(guān)。
相反，導(dǎo)致該酶過度表達(dá)的突變是溶血性貧血的一個(gè)原因。
有證據(jù)表明不同的等位基因（ADA2）可能導(dǎo)致孤獨(dú)癥。
ADA水平升高也與艾滋病有關(guān)。
異構(gòu)體
有兩種ADA同種型：ADA1和ADA2。
ADA1存在于大多數(shù)體細(xì)胞中，特別是淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中，它不僅存在于胞質(zhì)溶膠和細(xì)胞核中，而且還存在于與二肽基肽酶-4（aka，CD26）連接的細(xì)胞膜上的外胚層中。N-（2-乙酰氨基）-亞氨基二醋酸1主要參與細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)，并且以小形式（單體）和大形式（二聚體）存在。小型到大型的相互轉(zhuǎn)換受肺中“轉(zhuǎn)換因子”的調(diào)節(jié)。
ADA2首次在人類脾臟中發(fā)現(xiàn)。隨后在包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的其他組織中發(fā)現(xiàn)它與ADA1共存。這兩種同種型調(diào)節(jié)腺苷與脫氧腺嘌呤核苷的比例，增強(qiáng)了寄生昆蟲的殺滅。ADA2主要存在于人血漿和血清中，并且僅作為同型二聚體存在。
臨床意義
ADA2是人血漿中存在的主要形式，并且在許多疾病中增加，特別是與免疫系統(tǒng)相關(guān)的疾病：例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，牛皮癬和結(jié)節(jié)病。在大多數(shù)癌癥中血漿ADA2同種型也增加。ADA2不是普遍存在，而是僅在單核細(xì)胞?- 巨噬細(xì)胞中與ADA1共存。
可以使用高效液相色譜法或酶法或比色法測(cè)量總血漿ADA。也許最簡單的系統(tǒng)是測(cè)量腺苷在分解為肌苷時(shí)釋放的氨。在用腺苷的緩沖溶液溫育血漿后，氨與Berthelot試劑反應(yīng)形成藍(lán)色，其與酶活性的量成比例。為了測(cè)量ADA2，在孵育之前加入赤 - 9-（2-羥基-3-壬基）腺嘌呤（EHNA）以抑制ADA1的酶活性。缺乏ADA1引起SCID。
ADA也可用于淋巴細(xì)胞性胸腔積液或腹膜腹水的檢查，因?yàn)檫@種低ADA水平的樣本基本上不考慮結(jié)核病。
結(jié)核性胸腔積液現(xiàn)在可以通過增加胸膜液腺苷脫氨酶水平，每升40 U以上來準(zhǔn)確診斷。
克拉屈濱和Pentostatin是用于治療毛細(xì)胞白血病的抗腫瘤劑；它們的作用機(jī)制是抑制腺苷脫氨酶。
檢測(cè)方法演變
近十幾年來，隨著對(duì)ADA的深入研究，檢測(cè)方法也不斷發(fā)展。目 前已發(fā)展了四代。
第一代ADA測(cè)試
ADA將腺苷（Adenosine）脫氨產(chǎn)生肌苷（Inosine）和氨（NH3）。一個(gè)ADA活性單位在測(cè)試特定條件下每分鐘脫氨1μ摩爾腺苷成為次黃苷。通過動(dòng)態(tài)測(cè)量腺苷265nm處吸光度下降的速度，可以測(cè)算ADA的活性大小。Kaplan法（1955）由此建立。由于高底物濃度造成吸光度過高，該法僅適用于腺苷濃度低于40μM。如此低的底物濃度達(dá)不到底物飽和要求，造成ADA活性檢測(cè)失真。因此，該法不適用于臨床應(yīng)用。
第二代ADA測(cè)試
原理為腺苷脫氨酶催化腺嘌呤核苷水解，產(chǎn)生次黃嘌呤核苷和氨。然后用Berthelot顯色反應(yīng)（1859）測(cè)定反應(yīng)過程中產(chǎn)生氨的量，從而計(jì)算血清ADA活性單位。所需試劑易配制，儀器簡單，但靈敏度低，易受外源性NH3影響，空白過高，不能直接測(cè)定紅細(xì)胞ADA活性。
同樣原因，ADA偶聯(lián)谷氨酸脫氫酶（谷氨酸鹽 Dehydrogenase， GLDH）反應(yīng)：
通過測(cè)量340nm處NADPH吸光度下降的速度來測(cè)算ADA活性。該法也因血清含氨干擾，以及測(cè)試系統(tǒng)中過高NADPH造成非特異性氧化而無成算。
第三代ADA測(cè)試
Kalckar氏應(yīng)用ADA偶聯(lián)嘌呤核苷磷酸化酶（嘌呤 核苷 磷酸化酶，PNP）和黃嘌呤氧化酶（黃嘌呤 Oxidase， XOD）反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法。通過測(cè)量293nm處尿酸鹽吸光度上升的速度來測(cè)算ADA活性。
但是，293nm時(shí)血清吸光度太高，造成臨床應(yīng)用不便。
第四代ADA測(cè)試
通過ADA偶聯(lián)PNP，XOD，過氧化氫酶（Catalase）和醛脫氫酶（醛基 dehydrogenase），借助過氧化氫（H2O2）反應(yīng)測(cè)量334nm處NADPH吸光度上升的速率來測(cè)算ADA活性。該法克服了以往ADA測(cè)試的困難，然而，鑒于試劑成本高，阻礙實(shí)際臨床使用。
最新對(duì)第四代測(cè)試方法的改進(jìn)為偶聯(lián)PNP，XOD和過氧化物酶（Peroxidase， POD）反應(yīng)。ADA酶解腺苷（Adenosine）脫氨產(chǎn)生肌苷（Inosine）；再通過PNP的作用，生成次黃嘌呤（Hypoxanthine）；后者在XOD氧化下生成尿酸（Uric Acid）和過氧化氫（H2O2）；最后在POD的作用下H2O2再與N-乙酯N-（2-hydroxy-3-sulfopropyl）-3-methylaniline （EHSPT）、4-氨基安替比林（4-aminoantipyrine， 4-AA）反應(yīng)（Trinder氏反應(yīng)），生成紫紅色的有色（Quinone dye）。通過動(dòng)態(tài)測(cè)量有色醌550nm處吸光度上升的速度來測(cè)算ADA的活性。從反應(yīng)原理可知NH4+對(duì)該法無影響。其原理反應(yīng)方程式如下：
反應(yīng)具有測(cè)定精密度高，抗干擾能力強(qiáng)，適合自動(dòng)化快速測(cè)定的特點(diǎn)，為臨床常規(guī)開展ADA檢測(cè)應(yīng)用創(chuàng)造了有利條件。
邁克生物腺苷脫氨酶（ADA）檢測(cè)試劑盒性能指標(biāo)
檢測(cè)方法：XOD-PAP法（第四代改良法），不與其它核苷反應(yīng)，無NH4+影響，靈敏度高。
劑 型：液體雙試劑，直接使用，避免復(fù)溶引起瓶間差。
線性范圍：0～200U/L，γ2≥0.99
準(zhǔn) 確 度：不準(zhǔn)確度正常水平≤15%，異常水平≤10%。
穩(wěn) 定 性：密閉避光貯存2～8℃可穩(wěn)定12個(gè)月，開瓶上機(jī)2～8℃避光穩(wěn)定30天。
抗干擾能力：標(biāo)本中膽紅素≤342umol/L，血色素≤200mg/dl，甘油三≤8.47mmol/L，維生素c≤4mg/dl 及NH4+對(duì)本試劑測(cè)定無影響。
適 用 性：適用于各種半/全自動(dòng)生化分析儀。
參考范圍：4～22U/L（37℃），建議各實(shí)驗(yàn)室建立自己的參考值范圍。
參考資料 >