酪氨酸酶（tyrosinase，TYR），別名多酚氧化酶、兒茶酚氧化酶、陳干酪酵素、酚氧化酶，是一種結構復雜的含多亞基的含銅氧化還原酶，是合成黑色素的關鍵限速酶。CAS編號為9002-10-2。
酪氨酸酶最初在1895年被科學家發現于發黑的紅屬蘑菇中，隨之被發現廣泛存在于自然界中，無論在細菌、真菌，還是動物、植物中，都能發現它的存在，而且在同物種不同器官組織中，酪氨酸酶的功能也不盡相同。其活性中心由含銅離子位點構成，即酪氨酸酶中每個亞基含2個銅離子，這2個銅離子與組氨酸的生物合成殘基結合，另有1個內源橋基將2個銅離子聯系在一起。當酪氨酸與酪結合成過渡配位化合物時，主要是羥基與酶的活性中心上的原子鍵鍵合發生作用。
酪氨酸酶在色素生成、果蔬褐變、傷口愈合中發揮重要作用。大多數治療色素沉著的方法是基于抑制酪氨酸酶的活性來發揮作用的。其是昆蟲防御機制中的一種重要酶，參與外骨骼的硬化，并可以將外骨骼包裹在黑色素中，以此避免其他生物的侵襲，此外還與昆蟲的傷口愈合、硬化、蛻皮和包囊有關，已經開發出具有滅活昆蟲體內酪氨酸酶作用的殺蟲劑。因此酪氨酸酶在醫藥、化妝品行業、食品、農業等領域被廣泛應用。
歷史
酪氨酸酶，最初在1895年被科學家發現于發黑的紅屬蘑菇中，隨之被發現廣泛存在于自然界中，無論從細菌、真菌，還是到動物植物中，都能發現它的存在，而且在同物種不同器官組織中，酪氨酸酶的功能也不盡相同。近年，酪氨酸酶在醫藥、美容、食品和環保等領域均有應用。
理化性質
酪氨酸酶，是一種含有金屬銅離子的具有氧化酚類物質作用的酶。酪氨酸酶廣泛存在于動、植物以及微生物的組織細胞中，與果蔬褐變、人色素障礙性疾病及其惡性黑素瘤的發生有重要著關系。酪氨酸酶是黑色素形成過程的關鍵酶。它的活性中心由含銅離子位點構成，即酪氨酸酶中每個亞基含2個銅離子，這2個銅離子與組氨酸的生物合成殘基結合，另有1個內源橋基將2個銅離子聯系在一起。當酪氨酸與酪結合成過渡配位化合物時，主要是羥基與酶的活性中心上的原子鍵鍵合發生作用。
催化原理
酪氨酸酶的單酚酶活性和二酚酶活性都是由于氧氣與兩個銅離子的結合體現的。一元酚與CuA結合，而二元酚與CuB結合，酪氨酸酶以氧化、還原、脫氧三種不同的狀態存在，發揮催化作用。苯酚的去質子化氧原子與氧化數酪氨酸酶活性中心的銅離子配合形成還原態配位化合物，裂解后轉化為鄰醌和脫氧態酪氨酸酶，脫氧態酪氨酸酶進行雙氧結合又形成一開始的氧化態酪氨酸酶，該循環持續進行，直至底物被耗盡。在單酚循環的反應過程中，如果處于自然狀態的還原態酪氨酸酶與單酚底物相遇，會發生極慢的氧化反應，阻礙單酚反應的正常進行，這一時期被稱為“滯后期”，因為還原態酪氨酸酶本身并不具備結合氧分子的能力。酪氨酸酶的雙酚酶活性主要是因為苯二酚的兩個相鄰羥基與活性位點的兩個銅離子結合來實現的。首先，鄰苯二酚與氧化酪氨酸酶的銅離子配合，酪氨酸酶活性位點的過氧橋斷裂，生成相應的1,2-苯醌和水，此時銅離子呈氧化數，表現為質子化形式；鄰苯二酚再次還原活性位點的銅離子，得到脫氧酪氨酸酶和鄰醌，酪氨酸酶結合氧氣分子恢復氧化態。
種類及分布
在對于植物及昆蟲的研究中，酪氨酸酶常被稱為多酚氧化酶、酚氧化酶，而在微生物和哺乳動物的研究中一般稱為酪氨酸酶。
酪氨酸酶的分布與生物的生理功能相關，在不同的生物體內，酪氨酸酶分布部位是不同的。多數昆蟲在正常生理狀態下，體內的酪氨酸酶多以酶原的形式存在。因此，不同類型的酪氨酸酶存在于昆蟲的特定部位，以完成特定的生理功能。例如，美洲蜚蠊存在于血紅細胞內，而麻蠅科則僅存在于血漿中，并且在表皮中主要以活化形式的酪氨酸酶存在。酪氨酸酶是單鏈型糖蛋白，在細菌和植物體內均為可溶性的，它能控制L－多巴轉化為L－多巴醌。在植物和低等生物中，這是黑色素形成的唯一路徑，而在哺乳動物中，還有其它相關蛋白質參與反應。
哺乳動物中酪氨酸酶與底物合成黑色素的過程發生在專門的細胞器中，它被稱之為黑色素體。黑色素體是與酪氨酸酶相關的配位化合物，涉及到色素的形成。當酪氨酸酶功能減退或缺失時，即會影響黑色素代謝，從而發生如白癲瘋和白化病等疾病。
作用過程
酪氨酸酶是黑色素形成的關鍵酶，酪氨酸酶首先催化酪氨酸羥基化為L-DOPA，再進一步催化L-DOPA為醌類化合物。醌類物質性質活潑，經過一系列非酶反應轉化為黑色素。該過程可大體分為兩個階段三個部分：第一階段就是酪氨酸被氧化生成多巴（L-DOPA）并進一步氧化生成多巴醌的過程，在這兩步反應都是由酪氨酸酶催化的，酪氨酸酶在這里顯示了獨特的雙重催化功能。酪氨酸酶是黑色素形成過程的關鍵酶。黑色素的轉變，有可能可以解釋惡性黑素瘤臨床和病理的某些變化，及快速增長的癌癥發病率。在美白化妝品中添加能抑制酪氨酸酶活性的美白劑，可以通過抑制酩氨酸酶活性直接抑制黑色素的形成，從而達到美白肌膚的目的。
結構
酪氨酸酶是一種復雜的多亞基雙核含銅金屬酶，是與人類黑素細胞表達相關的一種跨膜蛋白。由于人酪氨酸酶的高度疏水、結構復雜而靈活、樣品匱乏、分離純化困難等原因，利用現有的方法和技術很難獲得穩定的晶體結構，蘑菇酪氨酸酶因其易大量純化和商品化且與其他酪氨酸酶有很大的相似性已被廣泛用作替代人酪氨酸酶的有效模型。
蘑菇酪氨酸酶是一種H2L2四聚體，分子質量為120kDa。H亞基是酪氨酸酶的結構域，由13個α-螺旋、8個短b鏈和多個環組成；L亞基有一個類似凝集素的折疊，包含12條反平行的b鏈，含有150個氨基酸。酪氨酸酶的活性中心由兩個銅離子組成（通常被稱為CuA和CuB），每個銅離子都與三個保守的組氨酸的生物合成殘基（histidine，His）發生強烈的相互作用：CuA與His61、His85和His94配位，CuB與His259、His263和His296配位。兩個銅離子中心通過內源配位橋連接在一起。CuA的第二個組氨酸殘基和位于N端的半胱氨酸殘基之間能形成硫醚橋，這對于活性部位的穩定和活性作用的發揮必不可少。
制備方法
迄今為止，成功分離出酪氨酸酶的生物主要有真菌（包括霉菌、食用蕈菌、酵母菌等）、細菌、裸子植物、被子植物門，昆蟲，脊索動物類（包括人）。實驗中以食用菌與水果為主要酶源，常見原料包括蘑菇、馬鈴薯和蘋果等。實驗中所用的酪氨酸酶純酶大多為國外進口，價格昂貴且不宜大規模應用。
研究者通常借鑒國內外常用提取酪氨酸酶的方法，選用中國低價常用原料來制備酶液。例如有學者以pH為7.2的Na2HPO4－HCl緩沖溶液為體系，通過研磨擠壓、過濾、離心分離，提取馬鈴薯中的酪氨酸酶，用分光光度計在480nm處測定馬鈴薯提取液的吸光度，以吸光度對時間的變化率為反應速率，建立多巴溶液的轉換動力學曲線；發現所測數據波動小，酪氨酸酶的催化活性穩定性高，準確度高且效果好，但是多巴價格昂貴。另有學者以苯二酚（兒茶酚）為底物研究自制馬鈴薯酪氨酸酶，發現其催化產物的最大吸收波長為410nm，最佳反應條件為pH6.8、30℃；并用其處理羊毛織物，發現酪氨酸殘基被催化氧化為多巴醌結構，且能與含有—NH2的物質反應，為進一步研究羊毛改性奠定了基礎。還有學者以新鮮馬鈴薯、紅富士蘋果、紅蛇果、平菇和昆侖紫瓜為研究對象，從中分別提取酪氨酸酶并測定其酶活力，發現紫茄子的酪氨酸酶活力最為理想，并選擇鄰苯二酚作為紫茄子酪氨酸酶底物；而后研究了有機合成、無機鹽和天然提取物3大類抑制劑對酪氨酸酶的催化影響，發現有機合成化合物效果最佳。學者從產自伊朗北部的花生中提取酪氨酸酶。花生以液態氮為體系，隨后通過（NH4）2SO4沉淀和透析。電泳顯示存在2個可能的同工酶。酶活性在純化的不同階段中進行測定，也測量一些具有重要物理性質的酶。結果表明，花生酪氨酸酶的最佳pH為5.2、最適溫度為40℃。動力學研究也確定了米氏常數Km=257.5mmol，最大反應速度Vmax=0.00421mmol/min。
已從各種微生物中分離出不同特性的酪氨酸酶，但要用于商業目的，其成本高、效率低、產量少。隨著生物技術的成熟發展，利用基因工程構建大量高效的酪氨酸酶工程菌已成為可能。有學者對土壤細菌產酪氨酸酶進行分離和鑒定。通過離心分離，而后經過（NH4）2SO4沉淀法和超濾法獲得粗酶，除去褐色素（可能黑色素）后，通過體積排阻色譜進一步分離天然蛋白質混合物獲得純化酶。雙酚基質L-多巴、多巴胺以及單酚基質L-酪氨酸的動力學參數已確定，即Km為4.5、1.5和0.055mmol/L，純化酶最大活性條件為pH6.8。另有學者在微生物產黑色素的發酵條件研究中，將嗜麥芽假單胞菌感染的酪氨酸酶基因用重組脫氧核糖核酸技術轉入大腸桿菌HB101中，獲得了酪氨酸酶基因表達較好的工程菌WY8。還有學者采用比較酪氨酸酶的同源保守結構域氨基酸序列的方法設計引物，從蘇云金芽孢桿菌4D11中通過PCＲ擴增得到了包含酪氨酸酶基因的DNA片段，并在大腸桿菌中獲得了表達，驗證了該基因產生的黑色素可在一定程度上保護菌體免受紫外輻射，為構建產黑色素殺蟲脒基因工程菌提供了有益的參考。學者基于V.spinosum中的酪氨酸酶基因在大腸桿菌中的成功克隆，建立了1個酪氨酸酶在大腸桿菌中高效表達的有效模式，并對溫度、誘導物濃度以及不同操作模式下誘導的啟動時間進行了研究，經過28h的孵化獲得大約3g/L活性的酪氨酸酶。
應用領域
酪氨酸酶廣泛存在于動物、植物、微生物、昆蟲中，在色素生成、果蔬褐變、傷口愈合中發揮重要作用。酪氨酸酶是合成黑色素的限速酶，酪氨酸酶和酪氨酸酶相關蛋白1和2（酪氨酸酶P1和酪氨酸酶P2）參與黑色素的生物合成。酪氨酸酶和酪氨酸酶P1的變異與惡性黑素瘤的患病風險相關，抑制黑色素合成是黑色素瘤的輔助治療策略。黑色素與羽毛、眼睛、頭發和皮膚的顏色有關，其異常表達會導致色素沉著，造成諸如脂溢性角化病、黃褐斑、曬黑等結果，大多數治療色素沉著的方法是基于抑制酪氨酸酶的活性來發揮作用的。在大多數水果和蔬菜中，酪氨酸酶會導致受損細胞或衰老組織的酶促褐變，損害植物基食品的顏色和清晰度，導致營養品質的損失。酪氨酸酶是昆蟲防御機制中的一種重要酶，它參與外骨骼的硬化，并可以將外骨骼包裹在黑色素中，以此避免其他生物的侵襲，此外還與昆蟲的傷口愈合、硬化、蛻皮和包囊有關，已經開發出具有滅活昆蟲體內酪氨酸酶作用的殺蟲劑。因此酪氨酸酶在醫藥、化妝品行業、食品、農業等領域被廣泛應用。
相關研究
單酚酶活性的機理研究
在黑色素合成過程中，單酚底物被氧化數酪氨酸酶氧化為鄰醌是酶最主要的功能。這一過程是區別酪氨酸酶和兒茶酚氧化酶等其它氧化還原酶的重要特征。在單酚循環過程中，去質子化的苯酚上的氧原子與氧化態酪氨酸酶活性中心的銅離子配位形成配位化合物D，再通過親電取代機理，苯酚鄰位加氧過程形成復合物E，復合物E經歷分裂過程直接生成鄰苯二醌和脫氧態酪氨酸酶（deoxy）。脫氧態酪氨酸酶直接結合氧分子重新形成氧化態酪氨酸酶，這就是單酚酶活性的循環過程，這個過程直到底物反應完全后結束。在這個反應機理中，應當注意的是尚不知道苯酚羥基上質子的實際受體，其中活性中心的過氧基團上的兩個氧原子和Cu（A）上的組氨酸的生物合成殘基都已被作為潛在的質子化位點。在第一種情況下，過氧化物中心就會變為氫過氧化物，氧銅鍵發生斷裂，這可能導致配體與雙銅中心發生重排。同時，活性中心附近的殘基也有可能起到質子受體的作用。
單酚反應過程在一些生物合成過程中發揮著重要作用。科學家在單酚循環機理基礎上提出了酪氨酸酶催化2-氨基苯酚生成鄰亞胺醌的反應過程，并研究了反應過程的動力學行為。
此外，在單酚循環的反應過程中，自然狀態下的還原態酪氨酸酶如果遇見單酚類底物，就會發生極其緩慢的氧化反應，并且阻礙單酚反應的正常進行。因此，這段時期被稱之為“滯后期”。這是由于還原態酪氨酸酶自身不具有結合氧分子能力的緣故。
雙酚酶活性的機理研究
在雙酚循環過程中，氧化數的酪氨酸酶和還原態的酪氨酸酶都能與鄰二酚類化合物反應，完成雙酚循環過程．氧化態酪氨酸酶在氧化單酚的同時也能氧化雙酚，甚至比相對應的單酚氧化過程表現出更高的活性，這可能反映了不同的底物與活性位點定向結合難易程度的差異性，當單酚反應過程更容易與Cu（A）結合時，雙酚反應過程卻更容易與Cu（B）結合。雙酚氧化過程存在兩個反應過程，它們都是通過鄰羥基去質子化作用，才能使得氧連接到兩個銅原子上，從而完成與活性部位的配位結合。在氧化數酪氨酸酶與鄰苯二酚反應的過程中，酶被還原后生成還原態酪氨酸酶，它仍保持二價銅離子狀態。而在還原態酪氨酸酶與鄰苯二酚反應的過程中，酶的活性位點銅離子由二價變為一價。
雙酚循環的結果都是由鄰苯二酚/酶配位化合物從綁定的氧分子處分解產生相應的1,2-苯醌和水的氧原子從而解散過氧構象。
雙酚循環反應機理的研究不僅為黑色素前體鄰醌的合成提供堅實的理論基礎，對于其它類似研究也具有關鍵的指導作用。科學家在雙酚循環反應機理的基礎上研究了間苯二酚使酪氨酸酶失活的機理。這個過程的結果生成了失活態的酪氨酸酶，活性部位其中的一個銅由+2價變為0價，最終導致了反應過程的不可逆。
取代基\底物對于酶活性的影響
由于酪氨酸酶具有特異性的酶活性，因此很多學者著力于研究反應底物的選擇性。通過對銅III型蛋白的原子光譜和X－射線數據的分析，發現酪氨酸酶、兒茶酚酶以及血藍蛋白與氧結合的機制差異是由潛在的底物決定的。例如，血藍蛋白不能作為雙酚酶的氧化酶，而兒茶酚氧化酶不能作為單酚酶的氧化酶。此外，認為在哺乳動物細胞酪氨酸酶中，雙酚酶與Cu（B）連接而單酚酶與Cu（A）連接，這一結論與一些學者的研究結果相互矛盾，后者在總結大量研究結果的基礎上，發現活性中心與單酚底物的結合更容易發生在Cu（B）位置。
由于酪氨酸酶活性中心同時存在單酚酶活性和雙酚酶活性，二者必然會存在活性競爭關系，這個比值的大小需要通過動力學行為研究來確定。值得一提的是，活性中心銅離子的濃度同樣對于酶的活性產生不可或缺的影響。有學者研究并且確定了TyrBm（巨型芽孢桿菌的酪氨酸酶）的晶體結構，認為銅離子的濃度能夠影響酪氨酸酶的雙酚酶與單酚酶反應活性，通過改變銅離子的濃度，成功地改變了巨型芽孢桿菌中酪氨酸酶的雙酚酶活性。
參考資料 >
TYROSINASE.pubchem.2025-07-18