艱難梭菌（C·difficile）是一種革蘭陽性粗長桿菌，是抗生素相關性腹瀉和假膜性結腸炎的主要致病菌之一。艱難梭菌是人類腸道中的正常菌群成員，當人們長期使用或不正規應用氨芐西林、頭孢菌素、紅霉素、克林霉素等抗生素后，破壞了腸道菌群的生態平衡，引起腸道內菌群失調，耐藥的艱難梭菌大量生長繁殖，導致抗生素相關性腹瀉和假膜性結腸炎等疾病。
艱難梭菌芽孢呈卵圓形、芽胞直徑比菌體略大，位于次極端。嚴格厭氧，有周鞭毛。艱難梭菌最重要的致病物質是艱難梭菌毒素A（Tcd A）和（或）艱難梭菌毒素B（Tcd B），可滅活上皮細胞內的Rho蛋白家族，導致細胞凋亡并產生細胞病變效應，所致疾病統稱為艱難梭菌感染（CDI）。
艱難梭菌廣泛分布于土壤，多種家畜和野生動物、甚至人類的糞便中，該菌的無癥狀攜帶者是主要傳染源。和其它細菌感染性腹瀉一樣，艱難梭菌通過糞-口途徑傳播，也可通過食用污染的食品、水而傳播。人群普遍易感。兒童、老年人、有免疫抑制或慢性疾病者為高危人群，一些正在使用抗生素的患者是抗生素相關性腹瀉的高危人群。艱難梭菌感染（CDI）臨床癥狀主要有發熱、腹痛、腹瀉等，由單一腹瀉到中、重度感染。腹瀉初期為水樣便，后期可發展為膿血便。嚴重感染者伴有脫水、中毒性結腸炎和膿毒血癥，糞便中可存有黏膜狀物。CDI采用免疫學方法或者分子診斷方法，從有臨床癥狀病人的糞便標本中檢測到細菌產生的毒素或毒素編碼基因，用來輔助診斷。治療CDI的首要原則是盡可能停止正在使用的抗菌藥物；其次是口服有效治療藥物。內科治療除給予甲硝唑、萬古霉素等有效藥物外，其他藥物還有非達霉素、利福昔明、替加環素和靜脈注射免疫球蛋白等。外科治療包括結腸切除、結腸曠置回腸造瘺、保留結腸并萬古霉素沖洗術等干預手術。對于復發性 CDI，進行糞便菌群移植治療，其治愈率高達90%以上。
CDI的預防比較困難，尚無防疫新型冠狀病毒疫苗。醫療從業人員應重視手衛生并使用含氯化學消毒劑，合理使用抗生素，從而降低CDI的發病率。
命名
因為該菌對氧氣極為敏感，在最初發現時難以從糞便中分離和培養而被命名為艱難梭菌。
歷史
1935年，艱難梭菌最初由霍爾（Halland）和奧圖爾（O’Toole ）發現。1977年，臨床證實艱難梭菌與臨床上長期使用某些抗菌藥物引起的偽膜性結腸炎有關，從而引起醫學關注。1978年，Tedesco首次鑒定產生毒素的艱難梭菌與林可霉素治療后出現的假膜性結腸炎相關。直到1997年，艱難梭菌二元毒素才被發現，并逐漸受到重視。歐美很多國家已經把艱難梭菌列為法定傳染病必報的檢測病原體。
病原學
生物學特性
艱難梭菌為革蘭陽性粗大桿菌，長3.0～16.9μm，寬0.5～1.9μm。有周鞭毛，芽孢呈卵圓形，位于菌體的次極端，芽胞直徑比菌體略寬。艱難梭菌對氧氣極敏感，嚴格厭氧，且分離困難。血瓊脂平板上形成直徑比較大、顏色為白色或淡黃色的粗糙型菌落，不溶血；在環絲氨酸頭孢西丁果糖瓊脂平板可產生黃色菌落，紫外線等下可見黃綠色的熒光。艱難梭菌的芽胞對平常使用的化學消毒劑、抗生素、高濃度氧或胃酸等，均具有很強的抵抗力，但其繁殖體對這些因素則比較敏感。用環絲氨酸-甘露醇等特殊培養基可以從糞便中分離到艱難梭菌。健康人群的糞便檢出率約3%，其芽孢在外環境中可以存活數周至數月。
致病性
艱難梭菌的致病物質主要包括黏液層、細胞表面蛋白84和外毒素等。黏液層附著在細菌表面，黏液層蛋白A(SlpA)有利于艱難梭菌在腸道上皮細胞表面黏附和定植；細菌分泌的細胞表面蛋白84（cell surface Protein84,Csp84) 是一種黏膜裂解酶，能導致結腸黏膜的降解；多數致病性艱難梭菌菌株能產生艱難梭菌毒素A(Tcd A)和（或）艱難梭菌毒素B（Tcd B），部分菌株還可產生艱難梭菌轉移酶（這些細胞毒素導致細胞死亡的機制有所不同）。TCd A和TCd B都屬于葡糖基轉移酶，編碼這兩種毒素的基因（tox）位于染色體上，機體長期使用抗生素會導致腸道中的雙歧桿菌、乳桿菌屬等部分正常菌群被抑制，發生菌群失調，而耐藥的艱難梭菌大量繁殖并釋放毒素，可滅活上皮細胞內的Rho蛋白家族，導致細胞凋亡并產生細胞病變效應，是艱難梭菌最重要的致病物質。
傳播機制
傳染源
艱難梭菌廣泛分布于土壤，多種家畜和野生動物、甚至人類的糞便中，無癥狀攜帶者是重要的傳染源，包括60%~70%的新生兒、3%的3歲以上兒童、3%的成年人和10%的老年人等。
傳播途徑
艱難梭菌感染的傳播途徑主要是糞-口，也可通過食用污染的食品、水而傳播。人與動物的密切接觸也可以傳播。通過醫務人員的手或污染公共物品可造成醫院感染引起醫院內腹瀉傳播。
易感人群
人群普遍易感，沒有交叉免疫。兒童、老年人、有免疫抑制或慢性疾病者為高危人群，并且容易發生嚴重并發癥，一些正在使用抗生素的患者是艱難梭菌感染造成腹瀉的高危人群。
潛伏期
潛伏期為數小時至數天、數周。多數為急性起病，少數起病比較緩慢。
臨床表現
臨床上，大約15%～25%的抗菌藥物相關性腹瀉、50%～75%的抗菌藥物相關性結腸炎和95%～100%的霍亂樣綜合征是由CDI引起的。艱難梭菌感染（CDI）的臨床癥狀可由單一腹瀉到中、重度感染，包括發熱、腹痛、腹脹等。腹瀉初期為水樣便，24小時內常多于3次。后期可發展為膿血便。重癥患者的白色細胞增多。嚴重感染者的臨床表現為水樣便伴有脫水、中毒性結腸炎和膿毒血癥，糞便中可存在有黏膜狀物。患者臨床癥狀最早可出現在開始用藥后的數小時至2日之內，最晚可于停藥后3周內出現。
臨床常見用氨芐西林、克林霉素等抗生素治療5~10天后出現的水樣腹瀉，稱為抗生素相關性腹瀉。部分血水樣腹瀉患者會排出假膜，稱為假膜性結腸炎，患者有發熱、白細胞增多等全身中毒癥狀，嚴重者可危及生命。艱難梭菌感染在臨床上常伴有中毒性巨結腸、腸穿孔、感染性休克等并發癥，甚至最終導致死亡。
診斷檢查
診斷標準
艱難梭菌感染者由于無癥狀攜帶者比例較高，即使從糞便中分離培養到艱難梭菌，也不能作為診斷疾病的依據。可以分別采用免疫學方法或者分子診斷方法，從有臨床癥狀病人的糞便標本中檢測到細菌產生的毒素或毒素編碼基因，用來輔助診斷。
患者出現中度至重度腹瀉或者腸梗阻，一是糞便檢測CD毒素或產毒素CD結果陽性；二是內鏡下或組織病理檢查顯示偽膜性腸炎。滿足這兩個條件的任一條件，即可診斷為艱難梭菌感染。
實驗室檢查
一般檢查
輕度至中度艱難梭菌感染患者外周血白細胞可正常，嚴重感染者白細胞可達15×10 9 /L以上。血清降鈣素原(procalcitonin，PCT)大于0.2ng/ml時，提示CDI有重癥化趨勢。合并膿毒血癥時，相應臟器損害的功能指標異常，如血肌酐超過正常值1.5倍，血清白蛋白小于2.5g/L。
病原學檢查
標本采集
一般情況下，僅需要對便溏、水樣便或半成形便進行CD 檢測。對于疑似有CD感染和大腸梗阻的患者，應通過直腸拭子進行檢測。當出現明顯腹瀉癥狀 ( 24小時3次以上，持續時間超過2天）以及進行針對性治療前，采集不成形糞便標本送檢，送檢樣本不少于5ml，推薦采集10～20 ml。因為CD 毒素室溫下易降解，取材后應在2小時內送檢并立即檢測；對于不能立即檢測的，則需要將標本放置于4℃的冰箱內保存，保存時間不能超過 3天。
艱難梭菌菌株檢測
培養
厭氧培養有CCFA培養基和CD顯色培養基兩種培養方法。CCFA 培養基的培養時間為48～72小時。通過加熱糞便標本或乙醇預處理可以減少糞便正常菌群，篩選出細菌芽孢。菌落在紫外光下呈現黃綠色熒光，典型菌落可使用API 20A、Vitek 2 Compact 或者MALDI-TOF MS技術等進行鑒定。CD 顯色培養基的培養時間為18～24小時，無需對糞便樣本進行加熱或乙醇預處理。CD在顯色培養基上的菌落具有黑色、扁平、粗糙和邊緣不整齊等特點，可以直接鑒定CD。
谷氨酸脫氫酶檢測
谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase，GDH)用于篩查疑似CDI患者糞便樣本中是否存在CD。使用酶免疫方法(enzyme immunoassays，EIAs)直接檢測糞便標本中的GDH抗原。檢測時間約1至2小時。GDH試驗陰性，可直接報告臨床用于排除 CDI；GDH試驗陽性，則需要進一步檢測其毒素或毒素基因進行確證。
艱難梭菌毒素檢測
細胞毒性試驗
細胞毒性試驗(cell cytotoxicity assay，CCTA)，即細胞毒性中和試驗(cell cytotoxin neutralization assay，CCNA)，用于直接檢測糞便標本中存在的CD毒素。CCTA 是實驗室診斷CD的金標準，特異性強，敏感度高(最低可檢測出10pg毒素)。具體方法是，將糞便標本離心，上清經0.45μm濾膜過濾，將無菌PBS稀釋的糞便濾液加入細胞懸液(Vero或Hep2細胞)，分別加入和不加入抗CD毒素的中和抗體，37℃5%CO2環境培養，24小時、48小時后顯微鏡下觀察細胞病變效應(cytopathiceffect，CPE)，而加入特異性抗毒素抗體能阻止這種細胞病變。
產毒素培養
產毒素培養(toxigenic culture，TC)用于檢測CD菌株的產毒素能力。將糞便標本接種于CCFA培養基或CD顯色培養基上，37℃厭氧培養至少48小時，挑取典型菌落接種至液體培養基中，厭氧培養48小時，0.45μm濾膜過濾培養上清進行細胞毒性試驗。也可用EIAs檢測固體培養基上菌落產毒素能力，檢測時間為2～3日，但敏感度稍低。
毒素免疫檢測
常用EIAs（酶免疫方法）直接檢測腹瀉糞便標本中的CD毒素，用單克隆抗體特異性結合CD A/B毒素蛋白進行檢測。EIAs檢測CD毒素常和GDH檢測或核酸擴增技術(nucleic acid amplification tests，NAATs)聯合應用，用于 CD 感染實驗室兩步法或三步法診斷。
艱難梭菌毒素基因檢測
采用實時PCR或環介導等溫擴增法(loop-me-diated isothermal amplification，LAMP)等分子生物學技術，定性檢測糞便樣本中的 CD 毒素基因。檢測系統包括美國的GeneXpert(Cepheid)、法國的FilmArray(梅里埃)等，將樣品提取、純化、核酸擴增、產物自動化檢測整合，2小時內可以完成檢測。GeneXpert可以檢測tcdC基因的突變和缺失，預測高產毒菌株RT027型CD。采用NAATs檢測方法可作為唯一的獨立測試技術檢測產毒素CD。
實驗室診斷流程
三步法：先使用GDH試驗初篩，GDH陽性進行毒素EIAs試驗，二者結果不一致使用CCTA、TC或NAATs確證；兩步法：同步聯合檢測GDH和毒素EIAs試驗，二者結果不一致使用CCTA、TC或NAATs確證。
CT檢查
如果艱難梭菌感染患者結腸壁增厚、結節狀結腸袋增厚、水腫厚度大于4cm，特別是炎癥部位在升結腸時，CT檢查對于重癥CDI感染患者具有一定的輔助診斷意義。暴發性CDI常出現腹水、纜繩征等。
內鏡檢查
艱難梭菌感染在缺乏病原學依據或難以與其他炎癥性腸病相鑒別時，內鏡檢查是診斷CDI的重要手段之一。內鏡檢查下的特征表現為偽膜性病變，主要征象包括黏膜充血、水腫、糜爛、潰瘍、直腸乙狀結腸有多發性隆起的斑片或融合為大片的灰綠色、黃褐色偽膜覆蓋黏膜表面；嚴重者病變融合；偽膜鄰近的黏膜呈現水腫、充血，觸及易出血，也可見散在潰瘍；偽膜性病變主要累及左側結腸或全結腸，少數累及回盲部。部分CDI患者內鏡下表現不典型，尤其炎癥性腸病合并CDI時多無特征性偽膜性病變。
治療
根據患者感染的嚴重程度，給予不同的治療方案。治療CDI的首要原則是盡可能停止正在使用的抗菌藥物；其次是口服有效治療藥物。內科治療除給予甲硝唑、萬古霉素等有效藥物外，內科治療的其他藥物還有非達霉素、利福昔明、替加環素和靜脈注射免疫球蛋白等。
內科治療
治療方案
注意事項
外科治療
所有的CDI重癥患者均應進行腹部CT檢查，以明確是否存在中毒性巨結腸或全結腸炎，盡早確定外科干預的時機；若患者CDI導致的臨床情況不穩定，出現腸穿孔、中毒性巨結腸、內科治療無效、重癥感染性休克等狀況，應盡早進行外科干預，包括結腸切除、結腸曠置回腸造瘺、保留結腸并萬古霉素沖洗術等；結腸切除術的病死率高達25%～75%；手術應在血清DL-乳酸大于5mmol/L前實施；結腸次全切除術保留直腸的CDI患者，術后仍需持續進行內科藥物治療。
糞便菌群移植
預防免疫
艱難梭菌廣泛存在于醫療環境和自然環境中，預防CDI比較困難。醫療從業人員應重視手衛生并使用含氯化學消毒劑，對芽孢污染的醫療環境可采用過氧化氫氣化滅菌，合理使用抗生素等，可顯著降低CDI的發病率。尚無疫苗用于預防。
流行病學
CDI已經對對全球性公共健康造成威脅。美國和歐洲的CDI成為醫院相關性腹瀉的首要病因。美國疾病控制和預防中心 (Centers for Disease Control and Prevention，美國疾病控制與預防中心)于2013 年發布的統計數據顯示，美國每年CDI患者超過25萬，其中至少1.4萬人死于該種疾病。加拿大的CDI發病率從1997年的3.8/萬住院日上升至2005年的9.5/萬住院日。韓國的成人住院患者CDI發病率從2004年1.7/萬住院日上升至2008年的2.7/萬住院日。2007至2008年上海市一家醫院研究發現，其住院患者CDI的發病率為17.1/萬住院患者。
2002年之后，一種高產毒CD在北美和歐洲暴發流行，其PCR-核糖體分型027型/脈沖場凝膠電泳分型NAPl型/限制性內切酶分型BI型(簡稱RT027/NAP1/BI)，該型菌株引起的臨床癥狀更加嚴重且傳播性更強，易復發，預后差，導致CDI發病率快速增加。成為美國、比利時、英國和西班牙等國家和地區的優勢流行菌株。澳大利亞、墨西哥、智利、希臘、捷克和波蘭等國家也相繼發現此類高產毒株。中國的香港特別行政區、臺灣和大陸地區也相繼發現了RT027型菌株。在中國，引起感染的CD有其獨特的流行病學特征，主要流行菌株為RT017(ST37)，RT046(ST35)和RT012(ST54)。中國健康人分離的CD則以多位點序列分型ST54、ST3和ST2為主。
參考資料 >