木瓜蛋白酶（papain）是從未成熟的番木瓜果實乳汁中提取得到的白色至淺棕色粉末或液體，又稱木瓜酶，是一種含巰基的肽鏈內切酶，由單鏈組成，分子量為23406，含有212個氨基酸殘基。空間結構由α-螺旋和β-折疊構成。活性中心至少有三個氨基酸殘基，包括Cys25、His159和Asp158；每個木瓜蛋白酶分子由兩個組氨酸殘基（His-81、His-81）和7個半胱氨酸殘基（Cys）組成，其中6個半胱氨酸殘基形成了3個二硫鍵。
木瓜蛋白酶氣味有硫化氫臭，可溶于水和丙三醇，有一定的吸濕性。最適作用溫度為65℃，最適pH范圍是5～7。具有較高的熱穩定性和耐熱性，pH適用范圍廣且底物專一性低。能水解肽鍵、酯[zhǐ]鍵或酰胺鍵。
木瓜蛋白酶廣泛應用于食品、醫學、啤酒等領域。因為有抗菌、抗炎、利膽、止痛、助消化等藥理作用，所以臨床上可用作清創劑、助消化劑、抗炎劑，血型鑒別等。食品上則用于肉類嫩化、飼料加工、啤酒澄清、糕點松化。并且有美白、防曬、護膚和潔白牙齒的功效。還可用于紡織業的羊毛上色、蠶絲脫膠、皮革軟化、羊毛防皺。在細胞培養、去污方面也有很好的應用前景。
來源
木瓜蛋白酶廣泛存在于木瓜茶的根、莖、 葉和果實內，未成熟果實的乳汁中含量最高，全世界有30多個國家生產番木瓜，番木瓜原產于美洲熱帶地區，在中國的廣東、海南省、廣西、福建和臺灣等地均有番木瓜產出。
發現歷史
幾個世紀前就有酶療法的存在，那時南美洲的美洲原住民會用青木瓜的葉子促進消化和康復，墨西哥印第安人長期以來用巴婆樹和番木瓜樹上的葉子包裹肉進行煮制使肉質變嫩。后來明確主要是得益于木瓜蛋白酶的功效，但當時人們對酶的作用認識還不夠深入。
十九世紀七十年代，Wurtz和Bouchut發現木瓜蛋白酶能有效清除白喉的假膜，對結核性潰瘍和紅斑狼瘡也有治療效果。1902年L.B.Mendel提出木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶和菠蘿蛋白酶可治療疾病的觀點。
美國科學家Wallerstein于1911年從木瓜粉中提取出了木瓜蛋白酶，發現這種酶能除去啤酒中的蛋白質渾濁物。1913至1919年期間，Kirkheim和Wago觀察到注射胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、淀粉酶或胰酶制劑后發生的不良反應與蛋白胨休克癥狀類似，意識到這些酶有毒性反應，逐漸避免用粗制酶治病，開始轉向提純酶的研究。
1937年Balls和Lineweaver從新鮮木瓜汁中用分級鹽析法提取出木瓜蛋白酶結晶。
1940年，Glasser首次報道了用木瓜蛋白酶進行酶清創的方法。木瓜蛋白酶作為酶性清創制劑已經有數十年的使用歷史，但因嚴重的不良反應已經被美國食品藥品監督管理局（FDA）停止應用。1958年，Porter等人將免疫球蛋白分子用木瓜蛋白酶水解成抗原結合片段（即Fab）和可結晶片段（即Fc）。
1969年的時候，Husain和Towe報告了該酶的氨基酸排列順序。1970年完成了木瓜蛋白酶的序列測定，1971年使用分辨率為0.28nm的X晶體衍射法測定了其三級結構。
國際上在20世紀80年代曾經采用向肉畜的靜脈注射木瓜蛋白酶或菠蘿蛋白酶的做法來改善畜肉的嫩度。
藥理作用
主要有輔助抗菌、抗炎、利膽、止痛、助消化等藥理作用。
消炎止痛
木瓜蛋白酶只作用于壞死組織，分解炎癥部位的纖維蛋白或膿液中的黏蛋白，可清潔創面，促進膿液排出，助長新生肉芽，并消腫抗炎，促進藥物滲透和創口的愈合。臨床上用于治療水腫、炎癥以及驅蟲（線蟲）。用作清創劑被英國藥典和美國藥典所收錄，與胰蛋白酶、膠原酶聯用作為抗炎劑使用。
抗血栓
木瓜蛋白酶能將纖維蛋白溶酶原激活成為纖維蛋白溶酶，，促進纖維蛋白溶解，有間接溶栓作用，還可抑制血小板FIB-R的活化，進而抑制血小板聚集。
助消化
木瓜Caspase-3能促進人體內蛋白酶的活力，延長蛋白酶的作用，促進水解，消化和吸收；能加速體內新陳代謝，縮短乙醇在體內停留時間，降低酒精對機體的損傷，起醒酒、健胃的作用。與乳糖酶、胃蛋白酶、胰脂肪酶聯用作為助消化劑。
血型鑒別
木瓜蛋白酶對紅細胞膜表面的唾液酸有中和作用，增強IgG抗體的結合能力，與抗痛素聯用可避免對正常血型血清學實驗的干擾，對Rh血型系統靈敏度高。臨床上用于血型鑒別。
作用機理
木瓜蛋白酶有氧化型和還原型兩種存在形式，游離的-SH是酶活性所必需的，所以還原型木瓜蛋白酶才有水解蛋白質的能力。
木瓜蛋白酶的催化過程分為化和脫酰化兩個步驟。
第一步，底物的肽鍵、酯鍵或酰胺鍵斷裂，活性中心的半胱氨酸殘基被酰化形成酶復合物：
His-159激活Cys-25殘基上的疏基（-SH），發生質子轉移的Enz-S-親核攻擊底物RCOOR’（-NH2或-NHR’）上的碳基碳原子形成被底物酰化的酶配位化合物Enz-S-COR。
第二步，酰化的酶配位化合物脫酰化，使半胱氨酸殘基上的巰基重新游離出來：
Enz-S-COR中His-159殘基攻擊H2O，發生質子轉移，OH-親核進攻Enz-S-COR中的碳基碳原子，使Enz-S-COR中S-C鍵斷裂，脫酰化生成產物RCOOH，酶被還原為Enz-SH。
木瓜蛋白酶可分解蛋白質，并水解酰胺鍵和脂鍵，但它的反應速率會受到濃度（底物和自身）、抑制劑、激活劑、反應溫度和pH值的影響。當半胱氨酸25與氧化劑、重金屬、酸基試劑，過氧化氫等酶抑制劑結合后，酶的活性會受到抑制；還原型谷胱甘肽、還原劑半胱氨酸（或亞硫酸鹽）、乙二胺四乙酸二鈉、Cys，硫化物等激活劑與酶結合后，還原劑可使-SH從-S-S-鍵再生，EDTA可合金屬離子酶，因此酶的活力能得到激活。
應用領域
醫學領域
木瓜蛋白酶可將免疫球蛋白水解成兩個Fab片段和一個Fc片段，Fab片段可作為抗體藥物對某些特定疾病進行治療，目前已有多種Fab類抗體藥物被批準。木瓜蛋白酶可以促進腸胃消化，消炎消腫，驅逐腸道寄生昆蟲，與其他要藥物配合治療骨外傷和痣瘺病患，清除傷口創面及皮表上的潰瘍且不影響正常組織，促進中藥有效成分的煎出，治療濕疹，還可輔助Rh血型鑒定。臨床上常用于淋巴細胞白血病、青光眼、骨質增生、槍刀傷口愈合、血型鑒別、昆蟲叮咬等。
生物實驗
細胞培養過程中，可用木瓜蛋白酶分散動物細胞，既能水解肽鏈和酯鍵，也能分散成體的骨骼肌。比如木瓜蛋白酶可將大血管和微血管的的血管內皮細胞分離出來，進一步進行血管內皮細胞的培養，優點是收獲量大，但對內皮細胞的消化損傷較大。
食品工業
食品工業的加工過程中會產生動物羽毛和血液，魚類加工會產生魚排、魚頭等大量蛋白質下腳料，直接加工成飼料后動物難以消化，因為木瓜蛋白酶活力強、耐熱性和穩定性好，用于飼料加工可使這些下腳料水解成可溶性的小分子蛋白質及氨基酸，能提高吸收利用度。還可作為添加劑加入畜禽日糧中，幫助飼料消化、提高飼料的效價，減少飼用量，提高禽畜生長率。使奶牛增乳、提高奶質并預防乳腺炎。
木瓜蛋白酶可以分解啤酒酵母菌，得到的酵母提取物可制成香味濃郁的調味品。還可制成保健食品，輔助消化或制成各種營養保健液。用木瓜蛋白酶處理寵物食品可使其黏稠性降低，改變口感和風味，還具有驅蟲效果。
酒類
啤酒在低溫儲存時經常發生混濁，非生物混濁物質有蛋白質、多酚類化合物和少量的糖類。可使用木瓜Caspase-3作啤酒澄清劑，加入后酒體有機高分子化合物氮明顯降低，中小分子氮含量則相應增加，且隨著蛋白酶量的增加總酸會有所升高，泡持力下降， 在保證啤酒高清澈度的同時還改善了啤酒的口感及原有多肽和氨基酸的組成和比例，使啤酒品質提高。
肉類
老齡畜肉煮熟后口感粗糙且堅硬，因為肉中含有膠原蛋白蛋白質導致肉質降低。木瓜蛋白酶是嫩肉粉的主要成分之一，能促進肉中結締組織和膠原蛋白質的降解，破壞肉的結構，使肉的口感變得嫩滑，生成易被人體吸收和利用的小分子物質。，而且木瓜蛋白酶的熱穩定性強，在90℃時也不會完全失活，在肉品被蒸煮的期間使用也可充分發揮嫩化作用。
豆類
大豆蛋白在使用過程中存在等電點易沉淀，粘度隨濃度增大迅速升高等問題，木瓜蛋白酶通過酶改性改善其物理化學性質，提高大豆蛋白的水解效率。木瓜蛋白酶還有從蛋白質的水解物再合成蛋白質類物質的能力，能改善植物蛋白質的營養價值或功能性質，例如將甲硫氨酸并入到大豆蛋白質中。
糕點松化劑
木瓜蛋白酶能破壞巰基，降低面團筋度，提高餅干的成形性，降低碎餅率增加成品光澤度，并使餅干質地疏松，還可減少油脂和糖的用量。適用于各種風味和檔次的餅干、糕點及面包的制造。
美容
木瓜蛋白酶有超氧化物岐化酶（SOD）的特性，有防曬、美白和護膚的功效。木瓜蛋白酶可促進蛋白質合成和新陳代謝，令皮膚細膩光滑，使彈性蛋白和膠原蛋白增多，還可加速色素的分解代謝，有保濕、抗衰老和增白祛斑的作用，與DL-乳酸一起被制成乳膏和乳液等護膚產品。木瓜蛋白酶還能除去牙齒上蛋白質沉積物用于牙齒美白。
其他工業
紡織工業用菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和黑曲霉酸性蛋白酶使羊毛在低溫下進行染色，上色率和毛紗強度會顯著提高。化工行業里，可將木瓜蛋白酶加入洗滌劑中，將某些有機污垢分解為小分子后，增強污漬的水溶性從而去除污垢，木瓜蛋白酶是植物來源的酶，不會造成環境污染，增大了酶在洗衣粉上的應用潛力。工業上還用于蠶絲脫膠，皮革軟化、羊毛防皺等。
分子結構
木瓜茶果實中含有4種高度同源的蛋白酶，分別為木瓜蛋白酶（papain）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain）、木瓜蛋白酶Ω（papaya proteinaseΩ）日本海棠凝乳蛋白酶M（chymopapain M）。
其中木瓜蛋白酶是含巰基的肽鏈內切酶，屬于蛋白水解酶類化合物。由單肽鏈組成，含有211個氨基酸殘基，包括 19個Tyr殘基、5個Trp殘基和4個Phe殘基, 分子量約為23200Da，木瓜蛋白酶的活性中心部位至少含有3個氨基酸殘基，包括半胱氨酸25、His159和Asp158 ，與Asn175殘基一同構成了酶的活性部位。有六個半胱氨酸殘基形成了三對二硫鍵，分別為Cys-22與Cys-65、Cys-56與Cys-95、Cys-153與Cys-200。
木瓜蛋白酶的空間結構呈橢圓狀，由α-螺旋組成的L-區域和大量反向平行β-折疊片層組成的R-區域組成，又叫C端結構域和N端結構域。活性部位就在兩個結構域之間的裂縫中。活性中心的兩側是Cys25和His159，Cys-25位于L-區域起始α-螺旋上，L-區域有3個α-螺旋和5個疏水性氨基酸殘基。這些氨基酸殘基空間位置比較接近，有利于酶催化功能的發揮。
二硫鍵的結構決定木瓜Caspase-3具有高的熱穩定性、酸堿穩定性和去垢劑抗性，有較強的合成能力和蛋白酶水解能力，因此有穩定性好、耐高溫、活性強的特點。
理化性質
木瓜蛋白酶是白色至淺棕色粉末或液體，呈粉末狀時有一定的吸濕性，有硫化氫臭，可溶于水和56-81-5，在乙醇、三氯甲烷和乙醚等有機溶劑中幾乎不溶。水溶液為無色至淺黃色，有時為乳白色。在25℃時，水溶液測定比旋光度=66.7°（pH5.7）。蛋白質等電點（pI）為9.55。275～280nm處有紫外吸收峰 ，木瓜蛋白酶具有較高的熱穩定性，耐熱性強，最適作用溫度為65℃，90℃時也不會完全失活；在磷化氫~9的范圍內會穩定存在，pH＜3或pH＞11時則很快失活，在pH5.0的弱酸性條件下最穩定，最適pH范圍是5～7，在中性或偏堿性時均起作用。
分離純化
木瓜蛋白酶最原始的提取方法是烘干法，這種原始的提取方法不利于保持酶活性，制得的酶純度較低。也曾廣泛使用單寧沉淀法，此方法酶活力較高產率卻很低，還易對環境造成污染 。目前生產中多采用超濾、絮凝、鹽析等方法：
鹽析法
鹽析法中高濃度的中性鹽離子的水化能力可奪取酶分子的水化層使木瓜蛋白酶的膠粒失水沉淀。所以可用一定濃度的氯化鈉溶液或硫酸銨溶液進行鹽析，但得到的酶產品活性較低，因為大量的鹽使酶中灰分增加，所以鹽析法也是非理想的木瓜蛋白酶提取方法。
絮凝法
絮凝法是在木瓜乳膠水提取液中添加某種化合物，能與木瓜蛋白酶生成難溶性的復合物進而沉淀析出。此方法提取專一性不強，得到的木瓜蛋白酶純度低而雜質含量較高。
超濾膜分離法
超濾膜分離法是通過控制一定壓力和流量將處理后的清液通過中空纖維超濾膜進行超濾，大分子的木瓜蛋白酶在超濾過程中被截留，其他雜質則透過膜，截留率可達93%以上，此方法條件溫和，不易破壞生化物質，超濾后的木瓜蛋白酶純度和活力增加，是一種比較好的分離技術。但超濾過程中膜表面的濃差極化現象會使速率逐漸下降，還有酶在有機溶劑中易變性和有機溶劑殘留的問題。
超聲波法、親和膜色譜法、雙水相萃取法則是新型的提取技術，超聲波的空化效應和微射流效應可提高提取率，但得到的粗酶液含量低需進一步純化，親和膜色譜法則比柱親和色譜更易規模化生產，萃取分離法有收率高、易于連續化操作、無有機溶劑殘留和分離過程經濟的優點， 是較好的木瓜蛋白酶分離提取方法。
所有方法都是根據木瓜蛋白酶的物理化學性質對提取工藝進行優化得來的，通常是鹽析、過濾、離心、濃縮、結晶、干燥等各種方法的排列組合，以達到最大限度利用資源實現效益最大化的目的。
固定化酶技術
因為酶具有蛋白質特性，所以穩定性較差，對熱不穩定、易被強酸強堿和有機溶劑破壞，單次使用后喪失活性和催化能力，不能重復利用。將酶固定在高分子材料等特定載體上后，穩定性能顯著增強、貯藏期也得到延長、 便于分離回收、促使生產工藝實現自動化和連續化，降低成本，大大提高酶的利用率并縮短了反應時間。吸附法、包埋法和載體交聯法是木瓜蛋白酶的常用固定化方法。可利用的載體有改性后的竹材料、殼聚糖、磁性粒子、尼龍等，固定化的木瓜蛋白酶熱穩定性、 耐酸堿性等特性和功能都得到了優化和提高，能更好的發揮催化作用。
安全事宜
儲存
木瓜蛋白酶的活性中心有一個自由的巰基，易受到分子氧的攻擊粘性失活，需密封0～4℃處保存。
毒性
番木瓜蛋白酶是木瓜果實的組分，是無毒的，所以對每日允許攝入量（ADI）不作特殊規定，用量以GMP為限（FAO/WHO,2001）。
相關法規
GB2760—2014《食品添加劑使用標準》中規定，木瓜蛋白酶屬于酶制劑，可作食品工業的加工助劑用于餅干、肉禽制品及水解動植物蛋白。
木瓜蛋白酶藥物的不良事件報告使美國食品藥品監督管理局(FDA)下令禁止公司銷售未經批準的含木瓜蛋白酶的外用劑型藥品，因為木瓜蛋白酶可產生有害或接近致命的影響，比如超敏反應。
參考資料 >
Questions and Answers about FDA's Enforcement Action Regarding Unapproved Topical Drug Products Containing Papain.FDA.2023-08-17