綠色螢光蛋白（Green fluorescent protein；簡(jiǎn)稱GFP），由下村脩等人于1962年在維多利亞多管發(fā)光水母中發(fā)現(xiàn)，其基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在藍(lán)色波長范圍的光線激發(fā)下，會(huì)發(fā)出綠色螢光，整個(gè)發(fā)光的過程中還需要冷光蛋白質(zhì)水母素的幫助，冷光蛋白質(zhì)與鈣離子（ca(clo)2+）可產(chǎn)生交互作用。2008年10月8日，日本科學(xué)家下村修、美國科學(xué)家馬丁·沙爾菲和錢永健因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)和改造綠色熒光蛋白獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。綠色螢光蛋白現(xiàn)常被用來研究BOBBIN和細(xì)胞分裂、動(dòng)力學(xué)和泡囊運(yùn)輸、發(fā)育生物學(xué)等，并可應(yīng)用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的確定、體內(nèi)基因表達(dá)的測(cè)定、蛋白質(zhì)分子的定位、細(xì)胞間分子交流的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等。
構(gòu)造組成
由水母Aequorea 宋茜中發(fā)現(xiàn)的野生型綠色熒光蛋白
，395nm和475nm分別是最大和次大的激發(fā)波長，它的發(fā)射波長的峰點(diǎn)是在509nm，在可見光綠光的范圍下是較弱的位置。由海腎（sea pansy）所得的綠色熒光蛋白，僅有在498nm有一個(gè)較高的激發(fā)峰點(diǎn)。
在細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域中，綠色熒光蛋白基因常被用作為一個(gè)報(bào)導(dǎo)基因(reporter gene）。一些經(jīng)修飾過的型式可作為生物探針，綠色熒光蛋白基因也可以克隆到脊椎動(dòng)物（例如：兔子上進(jìn)行表現(xiàn)，并拿來映證某種假設(shè)的實(shí)驗(yàn)方法。
蛋白作用
綠色熒光蛋的發(fā)光機(jī)理比熒光素/熒光素酶要簡(jiǎn)單得多。一種熒光素酶只能與相對(duì)應(yīng)的一種熒光素合作來發(fā)光，而綠色熒光蛋白并不需要與其他物質(zhì)合作，只需要用藍(lán)光照射，就能自己發(fā)光。
在生物學(xué)研究中，科學(xué)家們常常利用這種能自己發(fā)光的熒光分子來作為生物體的標(biāo)記。將這種熒光分子通過化學(xué)方法掛在其他不可見的分子上，原來不可見的部分就變得可見了。生物學(xué)家一直利用這種標(biāo)記方法，把原本透明的細(xì)胞或細(xì)胞器從黑暗的顯微鏡視場(chǎng)中“揪出來”。
傳統(tǒng)的熒光分子在發(fā)光的同時(shí)，會(huì)產(chǎn)生具有毒性的氧自由基，導(dǎo)致被觀察的細(xì)胞死亡，這叫做“光毒性”，因此，在綠色熒光蛋白發(fā)現(xiàn)以前，科學(xué)家們只能通過熒光標(biāo)記來研究死亡細(xì)胞靜態(tài)結(jié)構(gòu)，而綠色熒光蛋白的光毒性非常弱，非常適合用于標(biāo)記活細(xì)胞。
然而，綠色熒光蛋白被發(fā)現(xiàn)20多年后，才有人將其應(yīng)用在生物樣品標(biāo)記上。1993年，馬丁·沙爾菲成功地通過基因重組的方法使得除水母以外的其他生物(如大腸桿菌等）也能產(chǎn)生綠色熒光蛋白，這不僅證實(shí)了綠色熒光蛋白與活體生物的相容性，還建立了利用綠色熒光蛋白研究基因表達(dá)的基該方法，而許多現(xiàn)代重大疾病都與基因表達(dá)的異常有關(guān)。至此，生物醫(yī)學(xué)研究的一場(chǎng)“綠色革命”揭開了序幕。
后來，美籍華人錢永健系統(tǒng)地研究了綠色熒光蛋白的工作原理，并對(duì)它進(jìn)行了大刀闊斧的化學(xué)改造，不但大大增強(qiáng)了它的發(fā)光效率，還發(fā)展出了紅色、藍(lán)色、黃色熒光蛋白，使得熒光蛋白真正成為了一個(gè)琳瑯滿目的工具箱，供生物學(xué)家們選用。目前生物實(shí)驗(yàn)室普遍使用的熒光蛋白，大部分是錢永健改造的變種。
有了這些熒光蛋白，科學(xué)家們就好像在細(xì)胞內(nèi)裝上了“攝像頭”，得以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)各種病毒“為非作歹”的過程。通過沙爾菲的基因克隆思路，科學(xué)家們還培育出了熒光老鼠和熒光豬，由于沙爾菲與錢永健的突出貢獻(xiàn)，他們與綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)者下村修共享了2008年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。
瑞典皇家科學(xué)院將綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)和改造與顯微鏡的發(fā)明相提并論，成為當(dāng)代生物科學(xué)研究中最重要的工具之一。
蛋白應(yīng)用
Kevin Sullivan's 實(shí)驗(yàn)室
酵母菌內(nèi)SPB 和微管動(dòng)力學(xué)
酵母菌中肌動(dòng)蛋白的動(dòng)力
果蠅中MEI-S332蛋白
果蠅有絲分裂和mRNA運(yùn)輸
網(wǎng)丙菌屬細(xì)胞骨架
網(wǎng)丙菌屬的趨化作用
網(wǎng)丙菌屬中細(xì)胞骨架動(dòng)力和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)
網(wǎng)丙菌屬中細(xì)胞動(dòng)力
細(xì)胞骨架動(dòng)力和胞內(nèi)運(yùn)輸
動(dòng)力學(xué)和泡囊運(yùn)輸
用GFP顯示小囊運(yùn)輸
用GFP觀察TGN運(yùn)輸
細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)和胞內(nèi)運(yùn)輸
用GFP觀察線蟲的神經(jīng)發(fā)育
分析果蠅神經(jīng)發(fā)育的不對(duì)稱性細(xì)胞分裂
線蟲Lin-14
Fischbach lab
用GFP觀察網(wǎng)丙菌屬的形態(tài)發(fā)生學(xué)
GFP在小鼠發(fā)育中的標(biāo)記方法
生物技術(shù)中的應(yīng)用研究
作為一種新型的報(bào)告基因，GFP已在生物學(xué)的許多研究領(lǐng)域得到應(yīng)用。利用綠色熒光蛋白獨(dú)特的發(fā)光機(jī)制，可將GFP作為蛋白質(zhì)標(biāo)簽（protein tagging），即利用脫氧核糖核酸重
組技術(shù)，將目的基因與GFP基因構(gòu)成融合基因，轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，然后借助熒光顯微鏡便可對(duì)標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)活體觀察。由于GFP相對(duì)較小，只有238個(gè)氨基酸，將其與其他蛋白融合后不影響自身的發(fā)光功能，利用GFP的這一特性已經(jīng)加深了我們對(duì)細(xì)胞內(nèi)一些過程的了解，如細(xì)胞分裂、染色體復(fù)制和分裂，發(fā)育和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。1996年，Ehrdardt等人首次報(bào)道了利用GFP的特性研究細(xì)胞分化蛋白FtsZ的定位。研究顯示FtsZ在細(xì)胞分裂位點(diǎn)形成了一個(gè)環(huán)狀物，且至少有9種蛋白在細(xì)胞分裂中起重要作用，盡管對(duì)這些蛋白功能仍然不是很清楚，但是利用GFP融合蛋白已經(jīng)搞清楚了它們聚合的順序以及在蛋白定位中的一些特征。利用GFP來檢測(cè)目標(biāo)蛋白的定位已為我們提供了一種對(duì)細(xì)胞內(nèi)的一些基本的生理過程進(jìn)行更詳盡觀察的新方法。
除用于特定蛋白的標(biāo)記定位外，GFP亦大量用于各種細(xì)胞器的標(biāo)記如細(xì)胞骨架、質(zhì)膜、細(xì)胞核等等。Shi等人曾報(bào)道將GFP融合到大腸桿菌細(xì)胞膜表面用作標(biāo)記蛋白，這一技術(shù)將有助于提高多肽庫的篩選效率、新型冠狀病毒疫苗的研制、構(gòu)建細(xì)胞生物傳感器用作環(huán)境檢測(cè)以及探測(cè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程等等。這些都為傳統(tǒng)生物學(xué)研究提供了新思路和新方法，成為交叉學(xué)科研究的熱點(diǎn)。
許多新發(fā)展的光學(xué)分析方法已經(jīng)開始利用活體細(xì)胞來進(jìn)行藥物篩選，這一技術(shù)能從數(shù)量眾多的化合物中快速篩選出我們所感興趣的藥物。基于細(xì)胞的熒光分析可分為三類：即根據(jù)熒光的密度變化、能量轉(zhuǎn)移或熒光探針的分布來研究目標(biāo)蛋白如受體、離子通道或酶的狀態(tài)的變化。熒光
探針分布是利用信號(hào)傳導(dǎo)中信號(hào)分子的遷移功能，將一熒光蛋白與信號(hào)分子相偶聯(lián)，根據(jù)熒光蛋白的分布情況即可推斷信號(hào)分子的遷移狀況，并推斷該分子在遷移中的功能。由于GFP分子量小，在活細(xì)胞內(nèi)可溶且對(duì)細(xì)胞毒性較小，因而常用作熒光探針。
在細(xì)胞體內(nèi)分子之間的相互作用非常復(fù)雜，其中很多涉及到信號(hào)分子在細(xì)胞器之間的遷移。例如當(dāng)信號(hào)分子和某一特殊受體結(jié)合后常會(huì)導(dǎo)致配體受體配位化合物從某一細(xì)胞區(qū)域遷移到另一區(qū)域，而這一遷移過程通常會(huì)介導(dǎo)一重要的生理功能。因而，這些受體常常被用作藥物篩選的目標(biāo)，若某一藥物具有與信號(hào)分子類似的功能，那么該藥物即具有潛在的醫(yī)藥價(jià)值。利用GFP熒光探針，將很容易從數(shù)量眾多的化合物中判斷出哪些化合物具有與信號(hào)分子相似的能引起配體一受體復(fù)合物遷移并介導(dǎo)生理反應(yīng)的功能，且這一篩選過程簡(jiǎn)單方便，所需成本也很低。利用這一原理，已經(jīng)成功構(gòu)建了一個(gè)篩選模型用于研究藥物介導(dǎo)的糖皮質(zhì)激素受體(hGR）的遷移過程。在一96孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，并以一編碼hGR GFP蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染該細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞用待篩選的藥物處理后，hGR-GFP從細(xì)胞質(zhì)遷移人細(xì)胞核的過程可實(shí)時(shí)或在某一時(shí)段內(nèi)被證實(shí)，根據(jù)熒光分布即可推斷哪一種藥物具有與hGR配體相類似的功能。利用GFP來進(jìn)行藥物篩選由于受其必須與遷移的信號(hào)分子相偶聯(lián)，其篩選容量相對(duì)較低，但是由于GFP在細(xì)胞內(nèi)的穿透性強(qiáng)及獨(dú)特的發(fā)光機(jī)制，因而在藥物篩選中具有相當(dāng)大的應(yīng)用潛力。
3．融合抗體
近二十年來，抗體生成技術(shù)有了飛速發(fā)展，已經(jīng)從細(xì)胞工程抗體（雜交瘤技術(shù)一單克隆抗體）發(fā)展到了第三代抗體：基因工程抗體，尤其是噬菌體抗體庫技術(shù)的出現(xiàn)，解決了人源抗體的研制問題，促進(jìn)了各種性能優(yōu)良抗體以及具有多種功能的抗體融合蛋白的開發(fā)。單鏈抗體（Single-chain v
ariable fragment，ScFv）是研究得較多的一種小分子抗體，其優(yōu)越性在于可在宿主細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)，易于基因工程操作，尤其易于構(gòu)建抗體融合蛋白。關(guān)于綠色熒光蛋白融合單鏈抗體的報(bào)道很多，國內(nèi)也有相關(guān)報(bào)道，如程虹等報(bào)道將抗肝癌單鏈雙功能抗體融合GFP真核生物表達(dá)載體并導(dǎo)人小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3表達(dá)并獲得成功。因融合抗體具有與抗原結(jié)合及發(fā)射熒光兩種特性，故這一人工分子可用做免疫染色的檢測(cè)試劑，直接應(yīng)用于流式細(xì)胞儀和免疫熒光的標(biāo)記及腫瘤的檢測(cè)等等。
由于技術(shù)上的的原因，一般融合抗體均置于原核生物表達(dá)系統(tǒng)如E.coli中表達(dá)。為便于表達(dá)蛋白的分離純化，一般在單鏈抗體的N端或C端插入一6×His序列，便于用Ni-NTA親和層析柱純化目標(biāo)蛋白。但這一技術(shù)也存在一些問題。由于抗體分子內(nèi)存在二硫鍵，而在原核表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)由于抗體不能正確折疊，容易形成包涵體，表達(dá)出來的目標(biāo)蛋白無活性，需要在氧化還原體系中進(jìn)行退火。但也有報(bào)道在動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中成功表達(dá)出具有抗原結(jié)合活性的單鏈抗體。若能成功解決融合抗體的表達(dá)問題，則在免疫染色及腫瘤檢測(cè)這一領(lǐng)域融合抗體將扮演極為重要的角色。
蛋白質(zhì)工程技術(shù)已經(jīng)開始采用將一具有信號(hào)傳導(dǎo)功能分子識(shí)別位點(diǎn)的分子結(jié)合到另一分子上來設(shè)計(jì)生物感受器。綠色熒光蛋白由于其獨(dú)特的光信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，以及在表達(dá)后易被周圍化學(xué)環(huán)境和蛋白之間的相互作用所影響的特性，因而極適于用做活細(xì)胞體內(nèi)的光學(xué)感受器。第一個(gè)基于GFP的生物感受器為ca(clo)2+感受器，由Romoser和Miyawaki幾乎同時(shí)提出。這一感受器原理是利用鈣調(diào)蛋白結(jié)合鈣離
子后引起的空間構(gòu)象變化導(dǎo)致兩種GFP突變體間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。但是由于大多數(shù)蛋白不能像鈣調(diào)蛋白那樣承受較大的空間構(gòu)象變化，為克服這一缺點(diǎn)，人們開始提出利用基因融合技術(shù)將一新的分子識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合到GFP上以構(gòu)建新的分子感受器。Doi和Yanagawa根據(jù)這一原理將TEM1 β-內(nèi)胺酶(Bla）融合到GFP上。當(dāng)缺少目標(biāo)分子時(shí)，GFP處于靜止?fàn)顟B(tài)不會(huì)產(chǎn)生熒光。但是當(dāng)目標(biāo)分子β-內(nèi)酰胺酶抑制蛋白（BLIP）與Bla結(jié)合后，即使GFP活化產(chǎn)生熒光，而這一變化很容易被檢測(cè)到。將受體蛋白插入到GFP表面的技術(shù)已經(jīng)成為構(gòu)建分子感受器的有力工具，這種GFP感受器能被用來檢測(cè)多種分子，如蛋白質(zhì)、核酸、激素、藥物、金屬及其他的一些小分子化合物等，其潛在應(yīng)用前景極為廣闊。
腫瘤發(fā)病機(jī)制的應(yīng)用
GFP是一個(gè)分子量較小的蛋白，易與其他一些目的基因形成融合蛋白且不影響自身的目的基因產(chǎn)物的空間構(gòu)象和功能。GFP 與目的基因融合，將目的基因標(biāo)記為綠色，即可定
量分析目的基因的表達(dá)水平，顯示其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)位置和量的變化，為探討該基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制提供便利條件。
在腫瘤的形成過程中，增殖和凋亡是一對(duì)相互矛盾的統(tǒng)一體。若腫瘤細(xì)胞凋亡占優(yōu)勢(shì)，腫瘤組織將長期處于休眠狀態(tài)或自行消亡。腫瘤細(xì)胞的凋亡受凋亡相關(guān)基因調(diào)控。用GFP轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，并與正常組織進(jìn)行比較，則大致可判斷此基因?yàn)橐种颇[瘤細(xì)胞凋亡的基因；反之，為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的基因。
腫瘤細(xì)胞浸潤是腫瘤細(xì)胞粘連、酶降解、移動(dòng)和基質(zhì)內(nèi)增殖等一系列過程的表現(xiàn)，其根本原因在于腫瘤細(xì)胞內(nèi)某些基因表達(dá)異常。利用GFP 的示蹤特性，研究腫瘤細(xì)胞內(nèi)某些基因異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞浸潤的關(guān)系，即可揭示腫瘤細(xì)胞浸潤的某些機(jī)制。
在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的應(yīng)用
新近研究發(fā)現(xiàn)，某些突變的 GFP 能夠發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (fluorescence resonance 能量 transfer,FRET）。FRET 是一種從熒光分子的激發(fā)狀態(tài)到臨近基態(tài)接受分子之間量子力學(xué)能量轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。FRET 發(fā)生的前提條件是，熒光接受分子必須在熒光提供分子釋放態(tài)所具有的波長范圍內(nèi)接受能量。如果供應(yīng)分子和接受分子相互定位在幾個(gè)納米之內(nèi)，則非常利于 FRET 的產(chǎn)生。因?yàn)?FRET 對(duì)于兩個(gè)熒光分子相互間的定位和距離高度敏感（在納米范圍內(nèi)）。兩個(gè)分子間微小的線性或空間定位關(guān)系的破壞可以強(qiáng)烈地改變能量轉(zhuǎn)移的效率。由于 FRET 能量轉(zhuǎn)移并非是 100 % 的效率，一個(gè)實(shí)用而有效的檢測(cè) FRET 的方法是，僅僅激發(fā)熒光供應(yīng)分子，然后計(jì)算供應(yīng)分子對(duì)于接受分子熒光釋放的比率。比值的變化是一個(gè)理想的觀測(cè)細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化的指標(biāo)。因?yàn)樗?GFP 分子在絕對(duì)濃度、細(xì)胞的厚度、激發(fā)源的能量度以及檢測(cè)的絕對(duì)效率等的影響。利用 FRET 可以作成 GFP 依賴的生物探針，現(xiàn)已有研究人員設(shè)計(jì)大分子或分子聯(lián)會(huì)物來改變 GFP 之間原有生理信號(hào)反應(yīng)的 FRET。
研究發(fā)現(xiàn)可以通過調(diào)節(jié) GFP 來改變 FRET。把一個(gè)釋放藍(lán)色熒光的 GFP 融合到一個(gè)綠色熒光 GFP 突變體上，并在它們之間介入一個(gè)蛋白酶敏感的間隔子，這兩個(gè) GFP 恰好可以發(fā)生 FRET，當(dāng)加入蛋白酶時(shí)，間隔子被切除，兩個(gè) GFP 之間的距離發(fā)生彌散性改變，F(xiàn)RET 被完全阻斷。該實(shí)驗(yàn)提示我們，可以通過偶聯(lián) GFP 到適當(dāng)?shù)?a href="/hebeideji/535748980351351207.html">轉(zhuǎn)錄因子、跨膜受體、細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)指示分子，來動(dòng)態(tài)觀測(cè)活細(xì)胞的生理功能。
在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，研究人員開始設(shè)計(jì) FRET 依賴的 Ca 2+ 敏感指示劑，其設(shè)計(jì)原理是，鈣調(diào)蛋白 (CaM) 通過肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK) 結(jié)合到 CaM 結(jié)合區(qū)。藍(lán)色熒光蛋白和綠色熒光蛋白通過 CaM 和 MLCK 區(qū)域融合在一起，當(dāng) Ca 2 + 增多時(shí)，形成更多的 Ca 2+ - CaM 配位化合物，并從 MLCK 結(jié)合到 CaM 結(jié)合區(qū)域。該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過改變兩個(gè) GFP 之間的距離，可以增加 FRET。另有一些研究人員，并沒有把兩個(gè) GFP 融合在一個(gè)單一結(jié)構(gòu)中，而是把一個(gè) GFP 融合到 凸輪 上，另一個(gè) GFP 融合到 CaM 結(jié)合區(qū)域。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng) Ca 2+ 結(jié)合到 CaM 上，出現(xiàn)分子間異源二聚體，兩個(gè) GFP 足夠接近而產(chǎn)生 FRET。這個(gè)實(shí)驗(yàn)提示了一個(gè)非常重要的現(xiàn)象，即 FRET 不僅可以在分子內(nèi)發(fā)生，而且還可以在分子間發(fā)生。
最近，有學(xué)者用 GFP 依賴的生物傳感器測(cè)量活細(xì)胞內(nèi)生化動(dòng)力學(xué)，通過利用帶有 GFP 標(biāo)記的蛋白激酶 A 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀測(cè)有關(guān) cAMP 的動(dòng)態(tài)熒光變化。通過融合藍(lán)色熒光 GFP 到調(diào)節(jié)亞單位或融合綠色熒光 GFP 到 PKA 的催化亞單位，設(shè)計(jì)出了 cAMP 傳感器。當(dāng) cAMP 濃度很低時(shí)，兩個(gè)熒光分子距離很近，并出現(xiàn) FRET，如果增加 cAMP 濃度，發(fā)生 FRET 的可能性急劇下降。利用該方法，可以檢測(cè)出 cAMP 的動(dòng)態(tài)變化，并開創(chuàng)了在整體條件下，研究 cAMP 調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的新方法。
GFP 的結(jié)構(gòu)雖然具有高度完整性，但是實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在 GFP 中某些確定的位置，插入外源基因，完全沒有喪失其熒光性。當(dāng)把 凸輪 插入黃色熒光 GFP 突變體中，得到 Ca 2+ 傳感器，當(dāng) Ca 2+ 結(jié)合到 CaM 上，導(dǎo)致生色團(tuán)去質(zhì)子化，使熒光強(qiáng)度增加 7 倍。當(dāng)在黃色熒光 GFP 中插入一個(gè) Zif268 鋅指結(jié)構(gòu)，可以得到傳導(dǎo) Zn 2+ 的 GFP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)熒光少量增加，為改變前的 1.7 倍，K d 值約 0. 4mmol。插入外源基因致使 GFP 熒光敏感性增強(qiáng)的現(xiàn)象，提供了一個(gè)獲取永久編碼傳感器去監(jiān)測(cè)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的新路徑。
瑞典研究人員不再盯著植物作為樣板，轉(zhuǎn)而將目光投向擁有高超太陽能光伏轉(zhuǎn)化能力的水母，開發(fā)出提升收獲太陽能的技術(shù)。利用水母身上提取的綠色熒光蛋白（GFP），該小組制作的裝置可用這些“黏黏綠”將紫外光轉(zhuǎn)化為自由電子。該小組制造的電池由在二氧化硅基底上被一個(gè)小縫隔開的兩個(gè)簡(jiǎn)單的鋁電極組成，GFP置于兩電極中間并起連接作用。當(dāng)把紫外光放進(jìn)來的時(shí)候，GFP不斷將光子抓走，并產(chǎn)生電子進(jìn)入電路產(chǎn)生電流。同時(shí)，GFP非常廉價(jià)，不需要昂貴的添加劑或昂貴的加工，此外，它還能被封裝成獨(dú)立的不需要外光源的燃料電池。科學(xué)家相信，此能源裝置縮小后可用來驅(qū)動(dòng)微小的納米設(shè)備。
神經(jīng)極性發(fā)育
tracking intracellular transport of peptide neurotransmitters using GFP Allen Lab
Enhancer trapping using tau-GFP as reporter localized to axons
其他應(yīng)用
細(xì)胞 surface organization in Natural Killer cells Dan Davis
localization of 鈣調(diào)蛋白 in S. pombe with GFP
GFP-plakoglobin and expression plasmids Klymkowsky lab
Molecular Motion Laboratory 耶魯大學(xué) University
Measuring diacylglycerol in vivo with a GFP-PKC chimera Tobias Meyer
Bentley Lab using GFP for on-line bioprocess monitoring & ctrl
Tracking viral proteins with GFP fusions
GFP vectors and technology
Clontech Inc.Supplier of constructs for making GFP fusions
DeltaVision 3D microscopy Platform optimized for imaging GFP in living cells in real 時(shí)間
GFP Expression Truly Amazing Web Site about GFP technology
Universal Imaging Corp. makers of the MetaGFP image processing platform
Quantum Biotechnologies IncSuppliers of GFP and BFP constructs
GFP in Arabidopsis
BabCo/Covance antibody to GFP
Lightools GFP plate illumination systems
GFP in Chlamydomonas
Other Interesting GFP 友情鏈接
GFP Resources for Teachers
Picture of Aequoria victoria,source of GFP
Structure of green fluorescent proteinFull 文本 of Yang et al Nature Structural Bio paper
Table of GFP mutant forms
應(yīng)用前景
野生型 GFP 合成后需經(jīng)一定的折疊過程形成正確構(gòu)象后才有功能，而且在 470 nm 處的熒光強(qiáng)度相對(duì)較低。為了改善 GFP 熒光特性（如摩爾吸收值及釋放波譜），對(duì) GFP 進(jìn)行了突變和重組實(shí)驗(yàn)。Chalfie 等 通過測(cè)定大腸桿菌和線蟲體內(nèi)重組 GFP 的熒光光譜發(fā)現(xiàn)，它和提純的天然 GFP 光譜完全一致。突變實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多數(shù)突變導(dǎo)致 GFP 部分或完全喪失熒光活性，但某種突變使 GFP 明顯地改變激發(fā)和釋放波譜。例如用 The 替代 Ser 65，在 490 nm 處出現(xiàn)一個(gè)單一激發(fā)峰值，激發(fā)后產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度是野生型的 6 倍，對(duì)光滅具有更強(qiáng)的抵抗性，并且出現(xiàn)紅移現(xiàn)象，該突變蛋白質(zhì)與 FITC 的性質(zhì)相似 ; 同樣 Leu 替代 Phe 64，即增加 GFP 的可溶性，熒光強(qiáng)度增強(qiáng) 35 倍。3 個(gè)氨基酸同時(shí)突變時(shí)，在 360 nm 至 400 nm 之間，出現(xiàn)最大激發(fā)峰，而且增大生色團(tuán)形成的機(jī)率，可溶性更強(qiáng)，熒光強(qiáng)度為野生型 GFP 的 18 倍。現(xiàn)有人認(rèn)為，低濃度 GC 含量是 GFP 低表達(dá)的原因之一，為此，研究人員合成了高 GC 含量的特殊 GFP，并且發(fā)現(xiàn)這種 GFP 有更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。此外，用人蛋白質(zhì)中偏愛的密碼子替代相應(yīng)的野生型 GFP 中密碼子可提高 GFP 在哺乳動(dòng)物中的表達(dá)效率。許多 GFP 突變蛋白，不僅改變了激發(fā)和釋放波譜，而且提高生色團(tuán)形成的效率、溶解度、蛋白質(zhì)表達(dá)等。
不同的突變體給應(yīng)用提供了更廣闊的前景，但是也發(fā)現(xiàn)某些突變體在生理變化的 pH 值范圍內(nèi)顯示了更大的敏感性。研究人員利用一個(gè) pH 敏感的 GFP 突變體檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、高爾基體和線粒體基質(zhì)中的 pH 值，發(fā)現(xiàn)在這些區(qū)域測(cè)量到的數(shù)值與以前報(bào)道的測(cè)量值有非常好的吻合。GFP 依賴的 pH 檢測(cè)子，與小分子染料不同，這種檢測(cè)手段不必考慮染料滲透、環(huán)境水解等一系列問題，且 GFP 具有高度選擇定位性，適合于所有對(duì)于基因轉(zhuǎn)染敏感的細(xì)胞。更重要的是，這個(gè)實(shí)驗(yàn)說明利用組織特異性啟動(dòng)子GFP 檢測(cè)特定組織，通過融合到目的蛋白，可以檢測(cè)特定類型的細(xì)胞、細(xì)胞器或特定的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域中的 pH 值。這樣開創(chuàng)了檢測(cè)以前所不能到達(dá)部位 pH 值的可能性。
熒光蛋白已有非常廣泛的應(yīng)用，GFP 可應(yīng)用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的確定，體內(nèi)基因表達(dá)的測(cè)定，蛋白質(zhì)分子的定位和細(xì)胞間分子交流的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，免疫分析、核酸堿基探針分析，以及分子間第二信使鈣離子和 cAMP 水平的指示，細(xì)胞間隙pH 變化的檢測(cè)。另外，GFP 也可以和其他蛋白質(zhì)形成融合蛋白，作為基因治療檢測(cè)指標(biāo)。但是，GFP 在應(yīng)用中還發(fā)現(xiàn)有許多問題亟待解決 :⑴熒光信號(hào)強(qiáng)度的非線性性質(zhì)使得定量非常困難，⑵多數(shù)生物具有微弱的自發(fā)熒光現(xiàn)象，并有著類似的激發(fā)和發(fā)射波長，這個(gè)熒光背景會(huì)影響某些 GFP 的檢測(cè)，⑶實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)很難建成 GFP 穩(wěn)定細(xì)胞株，可能與 GFP 參與細(xì)胞凋亡過程有關(guān)，(4)另外，需要注意，由于GFP本身分子量較大，以融合蛋白形式表達(dá)的GFP有可能對(duì)蛋白本身的細(xì)胞定位等特性產(chǎn)生影響，在使用GFP作為標(biāo)簽時(shí)需要進(jìn)行仔細(xì)分析。
獲得榮譽(yù)
2008年10月8日，日本科學(xué)家下村修（伍茲霍爾海洋生物學(xué)研究所）、美國科學(xué)家馬丁·沙爾菲（哥倫比亞大學(xué)）和錢永健（加利福尼亞大學(xué)圣迭戈分校）因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)和改造綠色熒光蛋白而獲得了當(dāng)年（2008）的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。
在2008年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)上，綠色熒光蛋白成了主角。諾貝爾獎(jiǎng)委員會(huì)將化學(xué)獎(jiǎng)授予美籍日裔科學(xué)家下村修、美國科學(xué)家馬丁·沙爾菲和美籍華裔科學(xué)家錢永健三人，以表彰他們發(fā)現(xiàn)和發(fā)展了綠色熒光蛋白質(zhì)技術(shù)。在諾貝爾獎(jiǎng)新聞發(fā)布會(huì)的現(xiàn)場(chǎng)，發(fā)言人取出一支試管，置于藍(lán)光燈之下，只見這支試管中的物質(zhì)發(fā)出了綠色熒光……
2008年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了從事有關(guān)“綠色熒光蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，表達(dá)和發(fā)展”并取得重要成就的三位科學(xué)家：下村修、馬丁·沙爾菲和錢永健。
2008年諾貝爾自然科學(xué)獎(jiǎng)頒布后，相關(guān)的介紹與報(bào)道鋪天蓋地。其中一條新聞很有意思，在諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主下村修的出生地日本，養(yǎng)殖在一家水族館里的一種多管水母也一夜成名，吸引了無數(shù)人前來參觀，因?yàn)橄麓逍拚菑倪@種水母身上發(fā)現(xiàn)了后來讓他獲獎(jiǎng)的綠色熒光蛋白。其實(shí)下村修本人的經(jīng)歷，也如同這種水母一樣：作為綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)者，幾十年來一直默默無聞，甚至他本人當(dāng)初都沒有預(yù)見到該項(xiàng)發(fā)現(xiàn)的價(jià)值。如果不是后來幾位有技術(shù)、工程背景的研究人員在基礎(chǔ)研究和實(shí)際應(yīng)用之間架起橋梁，這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)恐怕還淹沒在論文堆中。與PCR(聚合酶鏈反應(yīng)）技術(shù)一樣，又一項(xiàng)與生物和生命科學(xué)有重要相關(guān)的技術(shù)獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。
參考資料 >