第二代脫氧核糖核酸測序技術，又稱下一代測序技術（next generation sequencing，NGS）或大規模平行測序（massively parallel sequencing，MPS），是一種高通量技術，也是第一代DNA測序技術劃時代變革的核心。它能夠一次對數百萬條DNA分子進行測序，具有大規模、高通量、短時間、低成本等特點，使得全基因組或全轉錄組的測序變得方便易行。
第二代DNA測序技術始于2005年。其主流平臺包括羅氏制藥454公司的GS FLX測序平臺、Illumina公司的系列測序平臺和ABI公司的固體測序平臺等。
在理論研究方面，第二代脫氧核糖核酸測序技術可運用于腫瘤學、遺傳學、免疫學、病原學、微生物學、寄生蟲學、藥學等多學科。在臨床診療方面，該技術適用于基因水平的檢測，并在感染性疾病診斷與產前診斷中發揮重要作用。
歷史沿革
歷史背景
DNA測序（DNA sequencing）作為一種重要的分子生物學實驗技術，在生物學、醫學等領域研究中有著廣泛的應用。1953年，DNA雙螺旋結構被沃森（Watson）和弗朗西斯·克里克（Crick）發現后不久，就有人報道過DNA測序技術，但是操作流程復雜限制了其推廣。1977年，英國科學家桑格（Sanger）引入雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP），發明了具有里程碑意義的末端終止測序法，簡稱Sanger法。同年，美國的Maxam和Gilbert合作發明了化學降解法測定脫氧核糖核酸序列，又稱Maxam-Gilbert測序法。這兩種DNA測序方法的建立，使測序技術實現了第一次質的飛躍。
隨著人類基因組計劃的完成，以鏈終止法測序為代表的第一代DNA測序技術已不能滿足生命科學和醫學研究的需求，研究人員希望通過更廉價、更快捷的方法全面、深入地分析各類物種的基因組、轉錄組及其與蛋白質之間相互作用的關系，于是，第二代DNA測序技術（next-generation sequencing，NGS）應運而生。
發展過程
2005年底，羅氏454公司推出了革命性的基于焦磷酸測序法的高通量基因組測序系統——Genome Sequencer 20 System。2006年，Solexa公司推出了基于邊合成邊測序（sequencing by synthesis）方法的IG Genetic Analyzer第二代測序儀，并很快被Illumina公司收購。隨后，ABI（ABI）加入第二代脫氧核糖核酸測序市場的競爭，并于2007年推出了SOLiD測序系統。
隨著時間的推移，羅氏制藥454公司的Genome Sequencer 20和ABI的固體測序系統逐漸被市場所淘汰，Illumina公司隨后推出的一系列第二代測序儀因其具有高準確性、高通量、高靈敏度和低成本等突出優勢最終占據了全球第一的第二代DNA測序市場份額。2015年，由深圳華大基因研究院研發的中國首款國產桌面型高通量基因測序儀BGISEQ-500問世，使得中國人在基因組學研究和應用方面不再受制于國際廠商的高價壟斷，一舉讓中國成為少數幾個掌握第二代DNA測序核心技術的國家之一。
技術平臺
第二代脫氧核糖核酸測序技術主要包括羅氏制藥454公司的GS FLX測序平臺、Illumina公司的系列測序平臺和ABI公司的固體測序平臺等。
Roche 454測序技術
Roche 454測序系統是焦磷酸測序原理，也是第一個商業化運營的第二代測序技術平臺。測序時，使用一種叫作“Pico Titer Plate”（PTP）的平板，它含有160多萬個由光纖組成的孔，孔中載有化學反應發光所需的各種酶和底物。測序開始時，放置在四個單獨的試劑瓶里的四種堿基，依照T、A、C、G的順序依次循環進入PTP板，每次只進入一個堿基。如果發生堿基配對，釋放一個焦磷酸。這個焦磷酸在各種酶的作用下，經過一個合成反應和一個化學發光反應，最終將熒光素氧化成氧化熒光素，同時釋放出光信號，此反應釋放出的光信號被儀器配置的高靈敏度CCD照相機實時捕獲。只要有一個堿基和測序模板進行配對，就會捕獲到分子的光信號；由此一一對應，準確、快速地確定待測模板的堿基序列。
454測序技術中，每個測序反應都在PTP板上獨立的小孔中進行，大大降低了相互間的干擾和測序偏差。該技術最大的優勢是平均讀長可達400bp。缺點是無法準確測量同聚物的長度，比如當序列中存在類似于聚腺苷酸（Poly A）的情況時，測序反應會一次加入多個T，所加入的T的個數只能通過熒光強度推測，導致測序不準確，引起插入和缺失的測序錯誤。
Illumina平臺測序技術
Illumina公司的測序技術基本原理是邊合成邊測序，先在脫氧核糖核酸片段兩端加上序列已知的通用接頭構建文庫，文庫加載到測序芯片流動槽（Flow cell）上，文庫兩端的已知序列與Flow cell基底上的Oligo序列互補，每條文庫片段都經過橋式PCR擴增形成一個簇，堿基延伸過程中，每個循環反應只能延伸一個正確互補的堿基，根據四種不同的熒光信號確認堿基種類，保證最終的核酸序列質量，經過多個循環后，完整讀取核酸序列。該測序技術是Solexa公司發展起來的，后被Illumina公司收購。測序過程主要分為以下4步：
脫氧核糖核酸文庫構建：利用超聲波把待測的DNA樣本打斷成片段，除了特殊要求外，大部分是打斷為200～500bp長的序列片段，這些小片段的兩端添加上不同的接頭，構建出單鏈DNA文庫。
流動槽：用于吸附流動DNA片段的槽道，當文庫建好后，文庫中的DNA通過Flow 細胞的時候會隨機附著在其表面的通道上。每個Flow cell有8個通道（channel），每個通道的表面都附有很多接頭，這些接頭與建庫過程中加在脫氧核糖核酸片段兩端的接頭相互配對，DNA在其表面進行橋式PCR擴增。
橋式PCR擴增與變性：以Flow cell表面所固定的DNA片段為模板，進行橋式PCR擴增。經過不斷的擴增和變性循環，最終每個DNA片段都集集成簇，每一個簇含有單個DNA模板的多份拷貝，使達到堿基的信號強度放大到測序所需要的強度要求。
測序：采用邊合成邊測序的方法，向反應體系中同時添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標記的4種dNTP。這些dNTP的3'-OH被化學修飾所保護，每次只添加一個dNTP，dNTP被添加到合成鏈上后，所有未使用的游離dNTP和脫氧核糖核酸聚合酶被洗脫掉，再加入激發熒光所需的緩沖液，激發熒光發光信號，光學設備完成熒光光信號的記錄，最后利用計算機分析將光信號轉化為測序堿基，熒光信號記錄完成后，再加入化學試劑淬滅熒光信號并去除dNTP的3'-OH保護基團，進行下一輪測序反應。
Illumina測序技術每次只添加一個dNTP，能夠很好地解決同聚物長度的準確測量問題，主要測序誤差來源是堿基的替換，錯誤率在1%～1.5%之間。
SOLiD測序技術
SOLiD測序技術是2007年開始ABI公司用于商業測序應用的儀器。測序基本原理：該技術平臺主要以四色標記的寡聚核苷酸連續的合成為基礎，對單拷貝脫氧核糖核酸片段進行大規模的擴增和高通量并行測序。SOLiD測序樣品制備過程中，首先物理破碎DNA，再連接通用接頭，在乳液體系里進行大量擴增，單分子多拷貝的DNA分子聚集于微小磁珠上，將經過擴增的富含測序文庫的磁性微珠固定于玻片表面進行測序反應。固體連接反應的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物，連接反應時，探針依據堿基互補規則與單鏈DNA模板進行配對，探針的5'端分別標記四種熒光染料，3'端1～5位為隨機堿基，其中1～2位構成的核苷酸堿基對表征探針染料類型的編碼區，堿基編碼矩陣規定此編碼區16種堿基對和4種熒光的對應關系。通常進行五輪連續測序反應，每輪測序反應含有多次連接反應，每輪測序反應的第一次連接應由與引物區互補的“連接引物”介導，5種含有磷酸基團且位置上只相差一個堿基的連接引物可以介導連接測序反應的進行。每個磁珠上的單鏈模板相同，經過每次連接反應后產生相應的熒光信號，而起始位點的堿基是已知的，因此可以根據雙堿基校正原則進行測序。“雙堿基校正”是固體技術平臺的一大特點，兩個堿基確定一個熒光信號，相當于一次能決定兩個堿基，因此也稱之為雙堿基測序法。
華大BGISEQ測序技術
2013年，深圳華大基因研究院收購了美國Complete Genomics公司，擁有了其全部測序專利、設備和軟件平臺，并在CG公司原有技術之上于2015年推出了BGISEQ-500基因測序儀。
文庫制備：與Illumina“建庫”策略不同，華大基因采取了一種環狀“建庫”的方式。首先，基因組脫氧核糖核酸經過片段化處理，再通過Klenow酶將黏性末端補齊為平行末端，用T4連接酶加上接頭形成雙鏈DNA片段，變性形成單鏈，并加入特殊的引物連接片段兩端的接頭，使之形成環狀單鏈DNA。環狀DNA構建好后立即進入下一步滾環擴增。
滾環擴增：滾環擴增的全稱為環狀DNA擴增（rolling circle amplification，RCA）技術，其目的與Illumina的“簇生成一樣，使單個DNA片段擴增放大以達到測序儀器所需要的信號強度。滾環擴增是以環狀單鏈脫氧核糖核酸為模板，通過一個短的DNA引物（與部分環狀模板互補），在DNA聚合酶催化下將dNTP合成到環狀DNA鏈上，由于DNA 聚合酶既有5'→3'聚合酶活性，又有3'→5'外切酶活性，就使得DNA聚合酶圍繞著環不停地轉圈，轉圈的同時復制出上千份單克隆鏈，拷貝在一段DNA上，就像一段毛線團一樣，這個毛線團被稱為DNA納米球（DNB，DNA Nano Ball），納米球里包含著需要測序的樣本片段。這種滾環擴增技術可將單鏈環狀 脫氧核糖核酸 擴增102～103個數量級，其最大的優點是不同于PCR指數擴增，滾環擴增依賴于DNA聚合酶直線擴增，其擴增錯誤不會累積放大。
應用
隨著人類基因組計劃的完成和測序技術的不斷發展，測序技術在生物學和醫學各個領域的應用越來越廣泛。在理論研究方面，第二代DNA測序技術可以運用于腫瘤學、遺傳學、免疫學、病原學、微生物學、寄生蟲學、藥學等多學科。在臨床診療方面，第二代DNA測序技術擁有傳統PCR法測序所不具備的靈敏、精確、價廉、信息量大等優勢，因而更適用于基因水平的檢測。憑借依托高效的高通量測序平臺，第二代脫氧核糖核酸測序技術在感染性疾病診斷、產前診斷（包括無創產前染色體病檢測、胚胎植入前遺傳學篩查與診斷）等方面發揮著重要作用。
產前診斷
《中國出生缺陷防治報告（2012）》指出，中國出生缺陷發生率在5.6%左右，且每年新增出生缺陷數約90萬例。缺陷不僅影響患兒本身的生活質量及身體健康，還給家庭和父母心理帶來沉重的負擔。出生缺陷可分為染色體疾病、單基因和多基因疾病，其中，第二代DNA測序技術在染色體疾病檢測上的應用效果最為顯著。以唐氏綜合征檢測為例，唐氏綜合征即21三體綜合征，是由于多了一條21號染色體而導致的疾病，唐氏患兒每新發一例，給家庭造成的損失大約在100萬元（2006年數據）。傳統唐氏篩查的辦法主要依靠血清學檢測母親外周血中的甲胎蛋白（AFP）、游離雌三醇（uE3）和人絨毛膜促性腺激素（HCG）水平，其準確率僅在70%左右，而診斷唐氏綜合征的金標準——羊水穿刺屬于有創檢測，會有0.3%的流產風險，一般唐篩高風險才會選擇進行。通過第二代脫氧核糖核酸測序技術對胎兒游離DNA的檢測可以準確分析出寶寶是否患有唐氏綜合征，其綜合檢出率>99%。第二代DNA測序技術在產前檢測的全稱是無創產前基因篩查（NIPT，non invasive prenatal DNA test），其最大優點是僅需要抽取5～10mL孕婦外周血就可以準確判斷出寶寶是否患有唐氏綜合征，提高了原有唐氏篩查的準確性，同時也避免了羊水穿刺帶來的風險。除此之外，NIPT還可以檢測胎兒其他染色體非整倍體的變異，例如18三體、13三體、X三體、X單倍體、克氏綜合征等染色體的異常，為全球出生缺陷的防治提供了有力保障。
腫瘤精準診斷
2015年1月20日，時任美國總統奧巴馬在國情咨文中提出了“精準醫學計劃”，其中，基于高通量測序技術的腫瘤測序是整個計劃的核心部分。由于第一代脫氧核糖核酸測序技術需要單個基因逐一檢測，既費時又消耗寶貴的腫瘤樣本，因此，第二代DNA測序技術更加適合腫瘤的臨床診斷。關于腫瘤的高通量基因檢測，有兩個主要的應用方向，一類是基于實體瘤的突變基因Panel測序，另一類是基于外周血或其他體液（如尿液、唾液等）的液體活檢。
腫瘤基因Panel測序
基因Panel檢測，即“基因組組合檢測”，是第二代DNA測序技術所帶來的一個新詞語，它同時靶向檢測多個基因上的多個位點，這些位點和基因需要按照臨床疾病類型進行選擇和組合，從而構成一個Panel。例如非小細胞肺癌患者，運用第一代測序儀僅能檢測EGFR（表皮生長因子受體）基因上的幾個主要突變位點，靶向藥物耐藥以后往往無計可施，而運用第二代脫氧核糖核酸測序技術則可以聯合檢測EGFR、KRAS（Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物）、BRAF（B-Raf原癌基因）、PIK3CA（磷脂酰肌醇4,5-二磷酸3-激酶催化亞基α）、ALK（間變性淋巴瘤激酶）、ROS1（c-ROS肉瘤致癌因子-受體酪氨酸激酶）等多個跟非小細胞肺癌相關的突變位點，為指導臨床診斷和治療提供了更多更全面的信息。2018年7月和8月，國家市場監督管理總局連續批準了兩個基于高通量測序技術（NGS）多基因腫瘤突變聯合檢測試劑盒，標志著腫瘤基因Panel測序正式進入臨床應用。
液體活檢
液體活檢（羧基液體丁腈橡膠 biopsy），也可稱為“無創腫瘤脫氧核糖核酸檢測”，是一種非侵入式的抽樣，能監測腫瘤或轉移灶釋放到血液的循環腫瘤細胞（CTC）和循環腫瘤DNA碎片（ctDNA）。其中，ctDNA在腫瘤的早期診斷、動態監測、發生發展及療效、復發風險評估等方面具有廣闊的應用前景，受到越來越多的關注。ctDNA樣本獲取雖然相對簡便，但在外周血中含量極低，只占血漿循環DNA的0.01%～1.00%，直到第二代DNA測序技術，數字化PCR技術和ARMS（擴增阻滯突變分析系統）技術的出現才解決了從極低度樣本中檢出ctDNA的難題。液體活檢的臨床應用有以下幾個方向：
①腫瘤分期：腫瘤患者每一時期的CTC含量和ctDNA突變情況與患者的腫瘤進展密切相關，液體活檢的實時監測可以輔助醫生對患者病情的掌握。
②預后評估：已在多種腫瘤中發現CTC數目與預后密切相關，如果治療效果好，CTC數量將會明顯減少；效果不好，CTC數量變化很小。
③精準用藥：研究表明ctDNA中的突變與腫瘤組織突變具有高度相似性，對血液中ctDNA的突變分析可以幫助醫生判斷患者腫瘤的突變類型，制訂用藥方案。
因此，基于第二代脫氧核糖核酸測序技術的液體活檢技術為腫瘤篩查、診斷和臨床決策提供了一種新的途徑和機遇，具有巨大的應用潛力。
參考資料 >
二代DNA測序技術.《刑事技術》編輯部.2026-02-08
硬招迭出！華大發布納米孔測序儀、基因檢測多模態大模型，推出 “探極計劃”.華大集團.2026-02-08