聚合酶鏈式反應（聚合酶 chain reaction，簡稱：PCR），又稱為基因體外擴增法，是由美國鯨魚座（Cetus）集團凱利·穆利斯（Kary Banks Mullis）博士于20世紀80年代中期發(fā)明的一種新型分子生物學技術，它可以利用DNA聚合酶的特性，在體外模仿生物體內DNA復制過程。因該技術具有高效、靈敏，易于操作及高特異性等特點，已在傳染病及遺傳病的診斷，生物醫(yī)學，分子生物學方面得到了廣泛的應用。
PCR技術在進行擴增的過程中主要包括以下三個步驟：變性、退火、延伸。自應用以來，其不僅成為分子生物學中的關鍵技術，也漸漸成為一項常規(guī)技術。自上世紀80年代中問世以來，該技術從只能單純擴增已知序列DNA片段，發(fā)展到應用于各個領域的幾十種PCR研究方法，檢測得效率和自動化程度都在不斷提高。但此技術仍有待改進之處，如進一步提高檢測的特異性、準確性和敏感性、減少試驗過程中的污染、減少實際應用的成本投入等。
1993年10月，PCR技術的發(fā)明者凱利·穆利斯博士成為當年瑞典皇家科學研究院頒發(fā)的諾貝爾化學獎得主之一，當時該技術被稱為“具有里程碑式意義的分子生物學技術”，并被業(yè)內列為90年代生物技術10大熱點之首。隨著生物學技術不斷發(fā)展，該技術被廣泛運用到基因研究、醫(yī)學領域、社會應用等方面，諸如基因圖譜建立、基因突變研究、臨床檢測、刑偵法醫(yī)、親子鑒定等。
發(fā)展歷史
1985年由穆利斯（Mullis）博士首先提出了PCR技術（聚合酶 Chain Reaction），即聚合酶鏈式反應，又稱為無細胞克隆技術，是一種對特定的序列DNA片段在體外進行快速檢測的新方法。瑞典皇家科學研究院于1993年10月13日向全世界宣布，穆利斯博士為1993年諾貝爾化學獎得主之一。PCR技術被稱為具有里程碑式意義的分子生物學技術，并被列為90年代生物技術10大熱點之首。PCR技術的產生依賴于一系列成果產生：Arthur Kornberg于1955年首次發(fā)現DNA聚合酶，該酶于1958年首次被純化成功；1955年-1970年間，科學家發(fā)現了DNA退火及引物沿5‘-3’方向延伸的熱動力學過程；Kjell Kleppe博士首次完成了PCR實驗，并提出了體外進行DNA復制的可能性；1971年Har Gobind Khorana首次提出擴增合成DNA的觀點，系統地闡述了PCR理論。熱穩(wěn)定DNA聚合酶的成功提取滿足了PCR變性時的高溫條件，該酶高溫條件下依舊保持活性，使得PCR反應得以自動化，具備多次進行循環(huán)的條件，因此PCR技術得到了突破性發(fā)展。機械物理學的高度發(fā)展，人們普遍采用DNA熱循環(huán)儀或自動化PCR儀進行操作，技術結構的改善推動了PCR技術發(fā)展。
PCR技術發(fā)展的趨勢顯示了如下特點：定量水平由粗略定量，半定量向精確定量，絕對定量的方向發(fā)展；在定量時，參照物選擇由簡單的外參照向多個參照定量演變；檢測手段已由樣本終點檢測向擴增動態(tài)連續(xù)檢測，并定量的方向發(fā)展；檢測方法已從手工，半自動步槍向成套設備的方向發(fā)展，而且檢測得效率和自動化程度都在不斷提高。
PCR方法也有很多有待改進的地方，如進一步提高檢測的特異性、準確性和敏感性、減少試驗過程中的污染、減少實際應用的成本投入等。PCR診斷方法的準確性與靶基因的選擇密不可分，現核糖體基因、線粒體基因、編碼蛋白基因以及其他特有的高拷貝數基因已被廣泛應用于寄生蟲病的PCR檢測，但不同的寄生蟲病所適用的靶基因不同，而隨著組學技術的發(fā)展，可挖掘更多的靶基因來提高PCR技術的準確性，因此未來還需要更多的研究來確定檢測各類寄生蟲的最優(yōu)特異性靶基因。
基本原理
PCR技術的原理: DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來啟動合成，通過一個或兩個人工合成的寡聚核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下，脫氧核糖核酸聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3' -OH末端，并以此為起始點，沿模板5→3°方向延伸，合成一條新的DNA互補鏈。PCR反應的基本成分包括模板DNA (待擴增DNA)、引物、4種脫氧核糖核苷酸(dNTPs)。DNA聚合酶和適宜的緩沖液。
PCR技術為特異性DNA體外擴增提供了一種十分簡便，快捷的新途徑，利用PCR技術能夠在幾個小時（2-4小時）之內將單個脫氧核糖核酸擴增106倍以上，實現可供檢測或者試驗操作的用量。其原理及反應步驟如下：最初利用人工合成兩個約20bp的片段核苷酸作為引物，使其與待擴增脫氧核糖核酸片段的兩端序列互補。接著，將引物摻入DNA片段中，隨后進行加熱變性處理，之后進行退火處理，在引物與DNA模板互補雜交后，再加入4種dNTP和DNA聚合酶進行擴增反應，由此完成PCR反應的第一輪循環(huán)。最后繼續(xù)進行加熱變性和退火操作，利用第一輪循環(huán)中擴增的DNA鏈作為模板進行下一輪擴增循環(huán)。
操作過程
反應體系
一般包括以下7個組分：模板、一對寡聚核苷酸引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、脫氧核苷三磷酸、緩沖液、二價陽離子和一價陽離子。
步驟
變性
變性是指通過升溫使目標脫氧核糖核酸雙螺旋的氫鍵斷裂，形成作為反應模板的單鏈DNA。脫氧核糖核酸的變性溫度會隨G+C含量的增加而增加。若模板脫氧核糖核酸含有更多的G+C，其解鏈溫度將會更高。另外，變性時間則與模板DNA的長度有關，DNA分子越長，則解鏈所需時間越長。
退火
退火就是當反應體系冷卻到一定溫度后引物和DNA模板互補組合生成模板-引物配位化合物。當退火溫度過高時，引物與模板的結合不理想，擴增效率將下降；退火溫度過低會使引物非特異性地結合模板脫氧核糖核酸而形成非特異性DNA片段。最適的退火溫度需要通過預實驗來確定，一般比理論計算出引物和模板的熔解溫度（Tm）低3℃-5℃。
延伸
延伸即將反應體系的溫度提高到熱穩(wěn)定脫氧核糖核酸聚合酶的最適溫度并持續(xù)一段時間。一般TaqDNA聚合酶的最適溫度范圍為72℃-78℃，在熱穩(wěn)定DNA聚合酶的作用下，以引物為起點，以四種單核苷酸為底物合成新的DNA鏈。在延伸后，單鏈模板DNA又形成了新的雙鏈。
反應五要素及其最適條件
聚合酶及其溫度
耐熱性脫氧核糖核酸聚合酶（Taq酶）的發(fā)現，使得PCR技術開始應用于臨床診斷。目前有兩種Taq酶供應：一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸桿菌合成的基因工程酶。Taq酶濃度過高會引起非特異性擴增，若濃度太低則產物合常量過少。
模板（靶基因）核酸
模板的純度一般不要求很高，不需要達到超純級。但脫氧核糖核酸溶液中不能有影響擴增反應的物質存在，例如蛋白酶、核酸酶、結合DNA的蛋白質等，另一類是尿素、k12、卟啉類物質等，還有一類是二價金屬離子的絡合劑(如乙二胺四乙酸二鈉）等會與鎂離子絡合，影響TaqDNA聚合酶的活性。模板脫氧核糖核酸的量一般對于單拷貝的哺乳綱基因組模板來說，100微升的反應體系中有100納克的模板就足夠，有時候模板太多會使得擴增失敗。
脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）
dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系。dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性,使用時應配成高濃度后,以1M 氫氧化鈉或IM 三羥甲基氨基甲烷 HCI的緩沖液將其pH調節(jié)到7.0~7.5，小量分裝，- 20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應體系中，dNTP量為50 ~ 200 μmol/L，尤其是要注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其他幾種時(偏高或偏低)，就會發(fā)生錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP 會絡合溶液中的Mg2+，而且大于200 μmol/L的dNTP會增加TaqDNA聚合酶的錯配率。如果dNTP的濃度達到1 mmol/L時，則會抑制Taq DNA聚合酶活性。
鎂離子（Mg2+）濃度
鎂離子濃度對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響。鎂離子濃度太低會無PCR產物，太高又會導致非特異性產物產生。故需要根據各自的預先實驗，以確定本實驗的最佳濃度，保證Taq DNA聚合酶具有良好的活性。
引物的要求
引物是PCR特異性反應的關鍵。PCR產物的特異性取決于引物與模板脫氧核糖核酸互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡聚核苷酸鏈作為引物，通過PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
引物的設計應遵循以下原則:
(1)引物長度: 15 ~ 30 bp，常用為20 bp左右。
(2)引物擴增片段長度：以200 ~ 500 bp為宜，特定條件下可擴增長至10 kb的片段。
(3)引物堿基: GC含量以40% -60%為宜，GC太少擴增效果不佳，GC過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
(4)避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。
PCR體系中其他成分
PCR反應緩沖溶液通常用10 mmol/L Tris . HCI(pH8.3, 20 ℃)，它是兩性離子中和劑。此外，還有50 mmol/L 氯化鉀，它有利于引物與模板退火。高于50 mmol/L的氯化鉀，或50 mmol/L的NaCl對Taq酶有抵制作用。明膠或血清白蛋白(100 ug/ml)及非離子去污劑，如Tween20等，對Taq酶起穩(wěn)定作用。
特點和優(yōu)點
1、高度靈敏性：PCR技術可以對極微量脫氧核糖核酸進行檢測和分析，Mullis等人采用PCR診斷鐮性細胞貧血癥，實驗結果顯示PCR檢測的靈敏度比Southern印跡雜交實驗高出100倍。
2、高度特異性：使用TaqDNA聚合酶時，PCR產物的特異性很高，其堿基錯配率只有10-4左右。
3、快速簡便和適用面廣：PCR技術被廣泛用于臨床診斷及基礎分子生物學研究中，如遺傳病產前診斷；從應用的方法來看，它既可以單獨使用，也可以與cDNA探針技術配合使用；從應用的范圍來看，凡是涉及微量脫氧核糖核酸鑒定、檢測和操作，都可以使用PCR技術；從應用對象來看，它既可以用于DNA微量檢測，也可以用于核糖核酸的擴增和檢測。
技術延伸
在PCR反應的過程中進行一定的修改即能產生不同的作用，因此關于PCR技術的延伸方向也極為多樣化，目前對PCR延伸技術主要分為以下幾類：
原位PCR
原位PCR（in situ PCR）就是在細胞或組織切片上進行PCR反應，它聚集了具有細胞定位能力的原位雜交特點和高度特異靈敏的PCR技術的優(yōu)點，在分子和細胞水平檢測特定的基因序列、轉基因及外源基因，對于研究疾病發(fā)病機理和臨床過程具有重大意義。原位PCR可以分為間接法和直接法。間接法是在固定組織或者細胞標本并用蛋白酶消化處理后，先通過PCR擴展靶細胞內特定的核苷酸序列的檢測及細胞內定位。直接法是在原位PCR進行前，在PCR反應液中加入標記好的核酸，隨著擴增的進行，標記物會直接摻入到PCR反應物中，隨后使用放射自顯影、免疫組化或熒光檢測技術對核酸分子進行細胞內定位檢測。間接法相對來說結果更加可靠，特異性強，但步驟稍微繁瑣；直接法有較高假陽性概率。
不對稱PCR
不對稱聚合酶鏈式反應是指在聚合酶鏈式反應中使用兩種不同濃度的引物，經過幾個循環(huán)后，低濃度的引物被耗盡，隨后的循環(huán)只產生高濃度的引物延伸產物，從而產生大量特定長度的單鏈DNA。用這種方法產生的單鏈脫氧核糖核酸可用做雜交探針或DNA測序的模板。不對稱PCR一般產率較低，不對稱PCR產量隨引物比率的不同而變化，而且反應中模板脫氧核糖核酸量決定了循環(huán)次數。
逆轉錄PCR
逆轉錄-PCR（Reverse transcription-聚合酶 chain reaction，簡稱RT-PCR）是用組織或細胞內的mRNA為模板，利用寡核苷酸(dT)或者隨機引物，通過利用逆轉錄酶逆向合成cDNA，然后使用cDNA為模板鏈進行PCR擴增得到目的基因或檢測基因表達。該技術主要用于基因轉錄物的分析，靶基因的獲取，cDNA探針的合成，或RNA高效轉錄系統的構建。
反向PCR
反向PCR（inverse PCR，IPCR）是將側翼區(qū)脫氧核糖核酸轉變?yōu)橐飪葒鷧^(qū)域，用合適的限制性內切酶在已知DNA序列之外切割?再將形成的限制性DNA片段連接成環(huán)狀分子。所用的引物和已知序列兩端順序同源。不同的是它們的 3’端方向轉向側翼區(qū)的未知DNA序列。經過一般的PCR擴增之后，其產物就是該環(huán)狀分子中未知序列的DNA片段。也可以將環(huán)化DNA線性化后再進行PCR擴增。反向PCR在研究轉位因子、反轉錄病毒以及所有可以整合或轉位到基因組中的其他DNA序列等方面都能取得良好效果。
定量PCR
定量PCR是指一種標準物為對照，通過對PCR最終產物的分析、PCR過程的檢測或對PCR起始模板量進行定量的技術。目前主要利用的定量PCR方法有極限稀釋法、設定內參照物的定量PCR以及熒光定量PCR（flurescence quantity PCR，FQ-PCR）等。定量PCR是在PCR技術基礎上改進的一種高靈敏度核酸定量技術。與傳統的PCR相比較，定量PCR能夠更加快捷、靈敏，并高效地對核酸進行定量檢測。
多重PCR
多重PCR（multiple PCR）又稱多重引物PCR或復合PCR，是在同一PCR反應體系中加入兩對或兩對以上引物，同時擴增多個核苷酸片段的PCR反應。其反應原理、試劑、操作過程與普通PCR實驗相同。在核酸診斷的許多領域，包括基因敲除、突變、多態(tài)性分析、定量分析以及核糖核酸檢測等方面有眾多應用。
巢式PCR
巢式PCR是PCR的一種改進形式，它由兩輪PCR擴增和兩組引物對的使用組成。步驟一，首先擴增目標脫氧核糖核酸；步驟二，從第一步反應產物中提取少量產物，作為第二步擴增的反應模板。第二PCR引物與第一反應產物的序列互補，第二PCR擴增的產物為目標產物。巢式PCR大多應用在當模板DNA含量較低且一次PCR難以獲得滿意的結果時，用巢式PCR技術的兩輪擴增就可以獲得很好的效果。
錨定PCR
錨定PCR（anchored PCR，A-PCR）是在基因未知序列端添加同聚物尾，人為賦予未知基因末端序列信息，用人工合成的與多聚尾互補的引物作為錨定引物，在與基因另一側配對的特異引物參與下，對同聚物尾的序列進行擴增。錨定PCR可克服未知序列帶來的障礙，對分析未知序列基因有特殊價值。另外，當已知某蛋白氨基端或羧基端序列時，錨定PCR還可以用于從基因組脫氧核糖核酸克隆該蛋白質基因。
免疫PCR
免疫PCR是一種新開發(fā)的靈敏性和特異性較強的抗原檢測系統，它利用抗原抗體反應的特異性和PCR擴增反應的極高靈敏度來檢測抗原，尤其適用于極微量抗原檢測，免疫PCR的主要優(yōu)勢在于特異性較強、靈敏度高以及操作簡單等。
重組PCR
將兩個不相鄰的脫氧核糖核酸片段重組在一起的聚合酶鏈反應稱為重組聚合酶鏈反應。基因表達調控是分子生物學研究的重要內容之一。為了研究基因結構與表達的關系，有必要構建基因缺失、插入、點突變等一系列突變體。有時需要將兩個不同的基因融合在一起以產生重組體，利用重組PCR構建突變體和重組體是一種非常有效的方法。
數字PCR
第一代傳統PCR技術采用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行分析，但該方法主要適用于定性和半定量研究。20世紀90年代初，第二代定量PCR技術問世（qPCR），盡管經過十幾年的迅速發(fā)展，qPCR技術已經達到快速、簡易和經濟的特點，但是qPCR所謂的“定量”仍然是相對的，依賴于Ct值和標準曲線。qPCR的準確度和重復性依然不能滿足分子生物學定量分析和臨床精確的診斷，在這種背景下，第三代PCR-數字PCR（digital PCR，dPCR）應運而生。與qPCR不同的是，數字PCR可以不需要對照標準樣本制作標準曲線實現絕對定量。
應用方向
基因研究
如基因圖譜建立、基因表達、脫氧核糖核酸遺傳、復制特定基因、基因突變研究、遠古DNA分析等。
醫(yī)學領域
如病毒感染、疾病檢測、遺傳病研究、胎兒早期檢測等。過去對病毒感染的臨床檢測多采用病毒培養(yǎng)、電鏡觀察和血清學等手段，但是診斷周期長，靈敏度不高。通過PCR技術的應用，尚未形成病毒顆粒的單個DNA分子可以迅速擴增到可用于診斷的水平，從而顯著提高了靈敏度并縮短了診斷的時間。應用PCR技術從基因水平上診斷癌癥已經在世界范圍內獲得成功。應用PCR技術可以快速、簡便且安全地進行遺傳性疾病的胎兒期診斷。
社會應用
如刑偵法醫(yī)、親子鑒定等。因為犯罪現場經常留下頭發(fā)和血跡，但數量極少，用普通方法無法檢測。利用技術從剩余的極少量脫氧核糖核酸片段中擴增出大量的DNA片段，就可以檢測到。用PCR技術擴增y染色體特定DNA區(qū)域149 bp的DNA片段和Alu重復序列300 bp的DNA片段。通過比較這些引物在不同性別間所產生的特異性條帶，來判斷其是否為雌雄性別的標記。若在PCR產物中檢測到兩條長度為149bp和300bp的條帶，則該產物為雄性；反之，若PCR產物中僅出現一條長度為300bp的條帶，則該產物為雌性。
其他應用
PCR作為一項具有革命性的技術，不僅在推動遺傳和分子生物學技術的發(fā)展方面發(fā)揮了重要作用，同時也在不斷地與該領域的核心技術進行融合和創(chuàng)新。PCR技術在分子生物學、臨床醫(yī)學、考古學等各個領域都取得了巨大的成就。
相關新聞
美國當地時間2019年8月7日，博士凱利·穆利斯（Kary Banks Mullis）因肺炎去世，享年74歲。《紐約時報》曾評價穆利斯的成就，“高度創(chuàng)新，非常重要，將生物學劃分為了兩個時代：PCR前時代和PCR后時代。”
參考資料 >
PCR之父、諾獎得主穆利斯去世，他將生物學劃分為兩個時代.澎湃新聞.2023-08-13