Taq DNA聚合酶是從一種水生棲熱菌（Thermusaquaticus）yT1株分離提取的·yT是 一種嗜熱真細(xì)菌，能在70～75℃生長(zhǎng)，該菌是1969年從美國(guó)黃石國(guó)家森林公園火山溫泉中分離的。
簡(jiǎn)介
Taq DNA聚合酶是從一種水生棲熱菌（Thermusaquaticus）yT1株分離提取的。yT是一種嗜熱真細(xì)菌，能在70～75℃生長(zhǎng)。該菌是1969年從美國(guó)黃石國(guó)家森林公園火山溫泉中分離的。該酶基因全長(zhǎng)2496個(gè)堿基，編碼832個(gè)氨基酸，酶蛋白分子為94KDa。其比活性為200000單位/mg。75～80℃時(shí)每個(gè)酶分子每秒鐘可延伸約150個(gè)核苷酸，70℃延伸率大于60個(gè)核酸/秒，55℃時(shí)為24個(gè)核苷酸/秒。溫度過(guò)高（90℃以上）或過(guò)低（22℃）都可影響Taq 脫氧核糖核酸聚合酶的活性，該酶雖然在90℃以上幾乎無(wú)DNA合成，但確有良好的熱穩(wěn)定性，在PCR循環(huán)的高溫條件下仍能保持較高的活性。在92.5℃、95℃、97.5℃時(shí)，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分別經(jīng)130min，40min和5～6min后，仍可保持50%的活性，實(shí)驗(yàn)表明：PCR反應(yīng)時(shí)變性溫度為95℃～20sec，50個(gè)循環(huán)后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性。Taq DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性是該酶用于PCR反應(yīng)的前提條件，也是PCR反應(yīng)能迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用的原因。Taq DNA聚合酶還具有逆轉(zhuǎn)錄活性，其作用類似反轉(zhuǎn)錄酶。此活性溫度一般為65～68℃，有Mn2+存在時(shí)，其逆轉(zhuǎn)錄活性更高。
催化活性
TaqDNA聚合酶是Mg2+依賴性酶，該酶的催化活性對(duì)Mg2+濃度非常敏感。以活性程度很低的三文魚精子脫氧核糖核酸為模板，dNTP的濃度為0.7～0.8mmol/L時(shí)，用不同濃度Mg2+進(jìn)行PCR反應(yīng)10min，測(cè)定結(jié)果為氯化鎂濃度在2.0mmol/L時(shí)該酶催化活性最高，此濃度能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性，Mg2+過(guò)高就抑制酶活性，當(dāng)Mgcl2濃度在10mmol/L時(shí)可抑制40～50%的酶活性。由于Mg2+能與dNTP結(jié)合而影響PCR反應(yīng)液中游離 的Mg2+濃度，因而Mgcl2的濃度在不同的反應(yīng)體系中應(yīng)適當(dāng)調(diào)整，優(yōu)化濃度。一般反應(yīng)中Mg2+濃度至少應(yīng)比dNTP總濃度高0.5～1.0mmol/L。適當(dāng)濃度的氯化鉀能使Taq DNA聚合酶的催化活性提高50～60%，其最適濃度為50mmol/L，高于75mmol/L時(shí)明顯抑制該酶的活性。
熱穩(wěn)定性
相對(duì)分子質(zhì)量為94的Taq 脫氧核糖核酸聚合酶的活性較高，大約為200000 U/mg，在合成DNA時(shí)有一個(gè)較高的最適溫度75～80℃。Taq DNA聚合酶雖然在90℃以上合成DNA的能力有限，但高溫時(shí)仍比較穩(wěn)定。有實(shí)驗(yàn)證明，在92.5℃、95℃和97.5℃時(shí)，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分別經(jīng)130min、40min和5～6min后，仍可保持50%左右的活性，其半衰期較長(zhǎng)。所以，在一個(gè)PCR預(yù)備試驗(yàn)中，每次循環(huán)時(shí)上限溫度為95℃處理20S，則循環(huán)50次后Taq DNA聚合酶仍可保持65%的活性，能夠保證實(shí)驗(yàn)的需要。
Taq DNA聚合酶具有很高的加工合成特性，在最適反應(yīng)溫度時(shí)，dNTP的摻入速度為35～100nt/（s．酶分子），最長(zhǎng)擴(kuò)增長(zhǎng)度可達(dá)7.6kb。在低溫條件下，Taq DNA聚合酶的活性明顯降低，導(dǎo)致此酶在模板內(nèi)局部二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域的延伸能力受阻或前進(jìn)速率常數(shù)與解離常數(shù)的比值發(fā)生改變。在較高的溫度（95℃以上）時(shí)，很少有脫氧核糖核酸合成；在體外，DNA在較高溫度時(shí)的合成速度受到引物或引物鏈與模板鏈雙鏈結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的限制。
由于Taq DNA聚合酶的最適反應(yīng)溫度高達(dá)75～80℃，故退火溫度和延伸溫度均可適當(dāng)提高，這限制了非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的出現(xiàn)，增加了PCR反應(yīng)的特異性。
功能
Taq DNA聚合酶的氨基酸順序，特別是氨基酸的前1/3區(qū)域，與大腸桿菌聚合酶I非常相似，因而它們屬于一種多功能酶。
1．具有5'→3'聚合作用
可以以脫氧核糖核酸為模板，以結(jié)合在特定DNA模板上的引物為出發(fā)點(diǎn)，將四種脫氧核糖核苷酸以Watson—Crick配對(duì)的方式按5'→3'方向沿模板順序合成新的DNA鏈。
2．具有5’→3'核酸外切酶活性
Taq DNA聚合酶具有依賴于DNA合成作用的鏈置換的5’→3’核酸外切酶活性，無(wú)論單鏈DNA還是退火到M13模板上，5’端P標(biāo)記的寡聚核苷酸均不降解。另外，如果模板上有一段退火的3’磷酸化的阻斷物會(huì)被逐個(gè)切換而不會(huì)阻止來(lái)自上游引物鏈的延伸，即它并不抑制在3'一OH末端上游引物的摻入。
影響因素
（一）溫度：雖然Taq 脫氧核糖核酸良合酶有很強(qiáng)的溫度適應(yīng)范圍，但高于60℃的環(huán)境仍會(huì)使部分酶變性失活。反之，如果溫度低于正常值，酶活性受到限制。而且由于引物在低溫下（特別是25—27℃）可能與基因組中別的部分同源釣序列結(jié)合，使得一些擴(kuò)增產(chǎn)物并非為目的序列。適當(dāng)提高溫度，錯(cuò)配堿基多會(huì)解離，反應(yīng)產(chǎn)物特異性增加。Taq DNA聚合酶的最適應(yīng)溫度以70℃為宜。
（二）鎂離子濃度：TaqDNA聚合酶活性對(duì)Mg的濃度非常敏感。TaqDNA聚合酶和許多其他聚合酶一樣，是Mg依賴性酶。用三文魚精脫氧核糖核酸作模板，dNTP的總濃度為0.9~0.8mmol/L，用含不同濃潑氯化鎂的PCR系統(tǒng)使反應(yīng)進(jìn)行10分鐘。測(cè)定結(jié)果表明：在MgCl2為2.0mmol/L條件下，酶活性顯示性高。Mg濃度偏高，酶活性會(huì)受到限制，10mmol/LMgCl2使酶活性抑制約50%。由于Mg可以與負(fù)離子或負(fù)離子團(tuán)（如磷酸鹽）結(jié)合，而在PCR中，DNA模板、引物以及dNTP是磷酸根的主要來(lái)源，其中dNTP占有很大比例。因此反應(yīng)系統(tǒng)中，Mg的最適濃度還要受到dNTP濃度的影響，欲獲得最佳反應(yīng)結(jié)果，要對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行必要的探索。每當(dāng)一個(gè)新的目的片段和引物第一次使用時(shí)，或者某種參數(shù)（dNTP或引物濃度）改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行Mg2+的最適濃度滴定。一個(gè)普遍的原則是，樣品中Mg的最終濃度至少要比dNTP總濃度高0.5~1.0mmol/L。
（三）氯化鉀的最適濃度：一般是50mmol/L，高于75mmol/L時(shí)，聚鏈反應(yīng)就受到明顯的限制。當(dāng)KCl濃度高達(dá)200mmol/L以上時(shí)，聚鏈反應(yīng)就受到明顯的限制，此時(shí)反應(yīng)進(jìn)行10分鐘仍無(wú)核苷摻入．濃度均為50mmol/L的NH4ClNH4Ac以及NaCl對(duì)TaqDNA聚合酶活性影響則分別為中等抑制、無(wú)影響以及25~30%促進(jìn)。
（四）dNTP的濃度：均衡的低濃度dNTP更有利于酶活性的發(fā)揮，并能減少錯(cuò)配，獲得多量的特異性強(qiáng)的脫氧核糖核酸反應(yīng)產(chǎn)物。各種核苷酸濃度為40umol/L的100ulPCR系統(tǒng)可以得到2.6ugDNA產(chǎn)物，而只消耗所提供核苷酸的半量。
（五）幾種變性劑對(duì)酶活性的影響：10%乙醇尚不抑制酶活性；二甲基亞（DMSO），二甲替甲胺（DMF）。甲酰胺在低濃度時(shí)對(duì)酶活性無(wú)影響，隨著它們濃度的提高，酶活性明顯下降。l0%DMSO會(huì)使酶活性減半。然而另有研究者觀察到，在某些聚鏈反應(yīng)系統(tǒng)中，10%DMSO起著有利作用。這種結(jié)構(gòu)各異的現(xiàn)象還表現(xiàn)在用尿素進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中。1.0mol/L尿素能提高酶活性，2.0mol/L尿素能保存大部分酶活性。然而也有報(bào)告認(rèn)為0.5mol/L尿素則完全抑制PCR?？傊?a href="/hebeideji/3946890881397428107.html">變性劑對(duì)TaqDNA聚合酶以及PCR系統(tǒng)的影響參數(shù)有待更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。TaqDNA聚合酶對(duì)SDS十分敏感，而某些非離子型去污劑又能完全消除低濃度SDS對(duì)酶活性的抑制效應(yīng)。例如，0.5%Twen20及0.5%NP40可抵消0.01%SDS對(duì)酶活性的影響。
校對(duì)活性
該酶無(wú)校對(duì)活性，易產(chǎn)生錯(cuò)配堿基。
TaqDNA聚合酶的種類
a、保真性的一個(gè)通用標(biāo)準(zhǔn)是錯(cuò)配率，錯(cuò)配率越低保真性越好。普通Taq酶的錯(cuò)配率在10-5堿基/循環(huán)數(shù)，而高保真 Taq酶錯(cuò)配率可降到10-6數(shù)量級(jí)，大大降低了出錯(cuò)的可能性；它適合對(duì)PCR保真性要求較高的實(shí)驗(yàn)，如基因篩選、測(cè)序、突變檢測(cè)等等。高保真aq酶的保真原理是：高保真Taq酶具有3‘到5’核酸外切酶的活性。市面上主要有兩類產(chǎn)品：一類是混合型的高保真酶，將帶有Proofreading活性的酶與普通Taq酶（用于提高擴(kuò)增效率）混合起來(lái)；另一類是單一型的高保真酶。
b、熱啟動(dòng)Taq酶（高特異Taq酶）：在PCR第一個(gè)循環(huán)變性之前，有一個(gè)升溫的過(guò)程，引物和模板會(huì)有一些非特異性配對(duì)，如果這時(shí)Taq酶發(fā)揮活性，就很容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，由于循環(huán)初期模板量非常少，產(chǎn)生的非特異性條帶經(jīng)過(guò)后面的指數(shù)擴(kuò)增，就會(huì)嚴(yán)重干擾目的片段的擴(kuò)增，甚至導(dǎo)致特異性條帶不能擴(kuò)出；而熱啟動(dòng)Taq酶是必需經(jīng)過(guò)高溫才能激活的酶，因此在初始循環(huán)的變性之前它沒有活性，不會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，這就大大提高了PCR擴(kuò)增的特異性。
c、高耐熱Taq酶：對(duì)于有些模板變性溫度較高，需要時(shí)間較長(zhǎng)，可能要求高耐熱性Taq酶，如NEB公司的Vent和Deep Vent 脫氧核糖核酸聚合酶系列，兩者都是從海底火山口分離出來(lái)后克隆的，是普通Taq酶耐熱性的三倍以上，前者在95°C半衰期近7小時(shí)，100°C近2小時(shí)；而后者分別為23小時(shí)和8小時(shí)。
d、超長(zhǎng)片段擴(kuò)增Taq酶：對(duì)于做基因組圖譜、測(cè)序及分子遺傳學(xué)研究的科研人員，可能會(huì)用到超長(zhǎng)片段的擴(kuò)增，Clontech公司的Advantage Genomic系列混有Tth DNA聚合酶，Proofreading酶和熱啟動(dòng)抗體，對(duì)復(fù)雜模板可擴(kuò)增10kb片段，簡(jiǎn)單模板可達(dá)40kb。
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參考資料 >