致突變試驗(yàn)是一種用于檢測化學(xué)致突變物的方法，主要用于篩查潛在的致癌物質(zhì)。這種試驗(yàn)是人類預(yù)防癌癥的重要手段之一，其中以細(xì)菌致突變試驗(yàn)的應(yīng)用最為普遍。
基因突變試驗(yàn)
鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(yàn)
又被稱為Ames試驗(yàn)，該試驗(yàn)旨在檢測受試物能否促使鼠傷寒沙門氏菌組氨酸的生物合成營養(yǎng)缺陷型突變株(his-)恢復(fù)為野生型(his+)。試驗(yàn)菌株均為組氨酸突變(his-)類型，無法自主合成組氨酸，在缺乏組氨酸的最低營養(yǎng)平板上無法生存。一旦回復(fù)突變?yōu)橐吧停纯勺晕液铣山M氨酸并在最低營養(yǎng)平板上形成可見菌落。通過計(jì)算最低營養(yǎng)平板上的回變菌落數(shù)目，來確定受試物是否存在致突變性。標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)菌株包括TA97、TA98、TA100和TA102，其中TA97和TA98檢測移碼突變，TA100檢測堿基置換突變，TA102對醛、過氧化物及脫氧核糖核酸交聯(lián)劑比較敏感。這些菌株不僅包含his-突變，還有其他附加突變，以增強(qiáng)其敏感性。
試驗(yàn)分為點(diǎn)試驗(yàn)（預(yù)試驗(yàn)）和摻入試驗(yàn)（標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)）。摻入試驗(yàn)中，受試物的最高劑量為5mg/皿或出現(xiàn)毒性及沉降的劑量，至少設(shè)置五個(gè)劑量點(diǎn)，并設(shè)有陰性（溶劑）對照和陽性對照。將受試物、試驗(yàn)菌株培養(yǎng)物和S9混合液添加到頂層培養(yǎng)基中，均勻涂抹在最低營養(yǎng)平板上，置于37℃環(huán)境中培養(yǎng)48小時(shí)，隨后計(jì)數(shù)可見菌落數(shù)。陽性的判斷標(biāo)準(zhǔn)是，如果每皿回變菌落數(shù)為陰性對照的每皿回變菌落數(shù)的兩倍以上，并且呈現(xiàn)出劑量-反應(yīng)關(guān)系，那么就認(rèn)為該受試物是鼠傷寒沙門氏菌的致突變物。
S9混合液是由多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿9000Xg上清液（S9）與NADP及葡萄糖-6-磷酸等輔助因子組成的代謝活化系統(tǒng)。如果不添加S9混合液獲得陽性結(jié)果，說明受試物是直接致突變物；只有在添加S9混合液的情況下才獲得陽性結(jié)果，說明該受試物是間接致突變物。只要在一個(gè)試驗(yàn)菌株中獲得陽性結(jié)果，就認(rèn)為受試物是致突變物；只有當(dāng)所有四種試驗(yàn)菌株均獲得陰性結(jié)果，才認(rèn)為受試物是非致突變物。
哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗(yàn)
哺乳動物體外培養(yǎng)細(xì)胞的基因正向突變試驗(yàn)通常使用的小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞、中國地鼠肺V79細(xì)胞和卵巢CHO細(xì)胞的三個(gè)基因位點(diǎn)突變，分別是次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）、胸苷激酶（TK）和Na+/K+ATP酶（OUA）位點(diǎn)。HGRPT和Na+/K+ATP酶位點(diǎn)突變可用于上述三種細(xì)胞，OUA位點(diǎn)突變僅適用于CHO細(xì)胞。HGRPT和TK可分別使6-硫代鳥嘌呤（6-TG）轉(zhuǎn)移上磷酸核糖及使5-溴脫氧尿苷磷酰化，它們的代謝產(chǎn)物可摻入脫氧核糖核酸導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，正常細(xì)胞在含有這些堿基類似物的培養(yǎng)基中無法生長，但在致突變物的作用下，這兩個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變的細(xì)胞對抗這些堿基類似物具有抗藥性，能夠增殖形成克隆。
染色體畸變試驗(yàn)
染色體分析
染色體分析是觀察染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)和數(shù)量變化的一種方法，國外常稱為細(xì)胞遺傳學(xué)檢驗(yàn)。這種方法可以通過顯微鏡觀察細(xì)胞染色體的變化。對于結(jié)構(gòu)畸變，常見的現(xiàn)象包括裂隙、斷裂、斷片、微小體、染色體環(huán)、粉碎、雙或多著絲粒染色體和射體。對于缺失，除染色單體缺失外，還需要進(jìn)行核型分析。對于相互易位，除配子非同源性染色體相互易位外，倒位、插入、重復(fù)等都需要顯帶染色才能發(fā)現(xiàn)。對于數(shù)目畸變，需要在染毒后經(jīng)歷一次有絲分裂才能被發(fā)現(xiàn)。然而，經(jīng)過一次有絲分裂后，一些結(jié)構(gòu)畸變可能會因遺傳物質(zhì)的丟失而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此無法被發(fā)現(xiàn)。因此，應(yīng)該安排多個(gè)收獲時(shí)間，以便分別檢查斷裂劑的作用。收獲時(shí)間的安排還應(yīng)考慮到外來化合物可能在細(xì)胞周期的不同時(shí)間段產(chǎn)生作用，以及延長細(xì)胞周期的影響。
體細(xì)胞的染色體分析可以在體內(nèi)或體外進(jìn)行。體內(nèi)試驗(yàn)通常觀察骨髓細(xì)胞，而體外試驗(yàn)常用的是中國地鼠肺細(xì)胞（CHL），以及中國倉鼠卵細(xì)胞（CHO）和V79等細(xì)胞系。然而，任何細(xì)胞系的染色體都不穩(wěn)定，難以準(zhǔn)確觀察非整倍體。因此，在體外試驗(yàn)中，如果要考慮進(jìn)行染色體數(shù)量觀察，應(yīng)該使用原代或早期細(xì)胞，例如人外周淋巴細(xì)胞。體內(nèi)試驗(yàn)與人體的實(shí)際接觸情況相似，但需要注意的是，受試物或其活性代謝產(chǎn)物可能不容易在骨髓中達(dá)到足夠的濃度。體外試驗(yàn)由于受試物與細(xì)胞直接接觸，因此常常比體內(nèi)試驗(yàn)更靈敏。
微核試驗(yàn)
微核試驗(yàn)是檢測染色體無著絲點(diǎn)斷片或因紡錘體受損而丟失的整個(gè)染色體在細(xì)胞分裂后期留下的子細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的次級核。常用嚙齒動物骨髓嗜多染紅細(xì)胞（PCE）微核試驗(yàn)。PCE是紅細(xì)胞成熟過程中的一個(gè)階段，此時(shí)紅細(xì)胞的主要核已經(jīng)排出，微核易于辨識。PCE胞質(zhì)富含核糖核酸染色，與成熟的紅細(xì)胞易于區(qū)分，因此是骨髓微核試驗(yàn)的理想細(xì)胞群體。常用小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，至少設(shè)置兩個(gè)處理組，最高劑量為LD50/7的80%（LD50/7是在7天內(nèi)使一半動物死亡的劑量），另一個(gè)組為LD50/7的40%，可通過灌胃或腹腔注射給予受試物，同時(shí)設(shè)置陰性和陽性對照組，每組至少8只動物，雌雄各半。給毒方案有多樣選擇，比如連續(xù)四天，每天一次。第五天處死動物，收集骨髓，制作涂片，固定并染色。每只老鼠計(jì)數(shù)1,000個(gè)PCE的微核出現(xiàn)率。當(dāng)經(jīng)過適當(dāng)?shù)?a href="/hebeideji/7233337346334277689.html">統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，處理組微核率明顯高于陰性對照組，并顯示出劑量-反應(yīng)關(guān)系時(shí)，就可以認(rèn)為受試物對該試驗(yàn)動物的骨髓細(xì)胞產(chǎn)生了致染色體損傷的作用。
DNA損傷試驗(yàn)
姐妹染色單體交換（SCE）試驗(yàn)
SCE是染色體同源位置上DNA復(fù)制產(chǎn)物的互換，SCE可能與DNA的斷裂和重組相關(guān)，暗示DNA損傷。SCE試驗(yàn)可分為體外試驗(yàn)、體內(nèi)試驗(yàn)和體內(nèi)、體外結(jié)合試驗(yàn)。體外SCE試驗(yàn)可以使用貼壁生長的細(xì)胞，如CHO、V79、CHL等，也可以使用懸浮生長的細(xì)胞，如人外周血淋巴細(xì)胞。細(xì)胞在含有5-溴脫氧尿苷（BrdU）的培養(yǎng)液中生長兩個(gè)周期。由于BrdU是嘧啶類似物，能夠在合成期內(nèi)摻入脫氧核糖核酸互補(bǔ)鏈，因此在下一個(gè)中期相中，每個(gè)染色體的姐妹染色單體之間都會有一條互補(bǔ)鏈摻入BrdU，使得姐妹染色單體的染色沒有區(qū)別。但是到了第二個(gè)周期的中期相，每個(gè)染色體中只有一條染色單體保留了原來的不帶BrdU的模板鏈，而另一條染色單體則是上一個(gè)周期帶BrdU的互補(bǔ)鏈成為模板鏈。因此，經(jīng)過兩個(gè)周期的BrdU摻入互補(bǔ)鏈可以使兩姐妹染色單體所含BrdU量不同，從而出現(xiàn)染色差異。如果BrdU僅在第一個(gè)周期摻入，第二個(gè)周期不摻入，則第二個(gè)中期相中可以看到姐妹染色單體染色有差異。如果脫氧核糖核酸單鏈發(fā)生了斷裂，并且在修復(fù)過程中發(fā)生了重排，就會在第二個(gè)周期看到姐妹染色單體同位節(jié)段的相互交換。經(jīng)過差別染色后，可以觀察到兩條顏色不同的染色單體。如果兩條染色單體之間發(fā)生了等位交換，可以根據(jù)每條染色單體內(nèi)出現(xiàn)深淺不同的染色片段進(jìn)行識別和計(jì)數(shù)。
程序外DNA合成試驗(yàn)
程序外DNA合成試驗(yàn)的基本方法是測量S期之外3H-胸苷摻入胞核的量，這個(gè)摻入量反映了DNA損傷后修復(fù)合成的數(shù)量。由于這種合成發(fā)生在脫氧核糖核酸正常復(fù)制合成的主要時(shí)期之外，因此被稱為程序外DNA合成（unschedule DNA synthesis UDS）試驗(yàn)或DNA修復(fù)合成試驗(yàn)。一般使用人淋巴細(xì)胞或嚙齒動物肝細(xì)胞等不處于正在增殖狀態(tài)的細(xì)胞較為方便，否則就需要人工將細(xì)胞阻斷在G1期，使其增殖同步化。然后在藥物的抑制下，使殘留的半保留DNA復(fù)制降至最低限度，這樣才能避免摻入水平極高的半保留復(fù)制對摻入水平極低的程序外DNA合成的觀察。
參考資料 >
致突變試驗(yàn)的概念.百度文庫.2024-11-07
鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(yàn).百度文庫.2024-11-07
遺傳性疾病檢驗(yàn)技術(shù)-姐妹染色單體互換檢驗(yàn).百度文庫.2024-11-07