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來源：互聯網

冷凍電鏡（Cryogenic-electron microscopy，Cryo-EM）是用于掃描電鏡的超低溫冷凍制樣及傳輸技術。可實現直接觀察液體、半液體及對電子束敏感的樣品，如生物、高分子材料等。

1931年，德國物理學家馬克斯·諾爾（Max Knoll）和他的學生恩斯特·魯斯卡（Ernst Ruska）發明了第一臺透射電子顯微鏡，并于1933年首次突破了光學顯微鏡的極限。1974年，加利福尼亞大學伯克利分校的Robert Glaeser和他學生Ken Taylor 首次提出冷凍電鏡。1982年，雅克?迪波什開發出真正成熟可用的快速投入冷凍制樣技術制作不形成冰晶體的玻璃態冰包埋樣品。1984年，雅克?迪波什首次發布不同病毒的結構圖像。1990年，理查德?亨德森成功利用電子顯微鏡在原子分辨率上生成了蛋白質的三維圖像。2013年之后，冷凍電鏡分辨率提高到接近原子水平。2016年報道了冷凍電鏡得到的谷氨酸脫氫酶的3D結構（334 kDa），分辨率甚至達到1.8?。清華大學隋森芳教授的光和反應實驗中，有一個捕獲光能的蛋白質復合體的重要結構被解析出來。2018年，中國科學技術大學教授畢國強、劉北明與加州大學洛杉磯分校教授周正洪組成課題組，利用冷凍電鏡技術對完整突觸進行了系統性定量分析。美國神經科學學會會刊《神經科學》以封面形式對此進行了報道。2019年，中國科學家利用冷凍電鏡技術解析到世界上分辨率最高的豬瘟病毒結構。

冷凍電鏡的基本原理是將樣品經過超低溫冷凍、斷裂、鍍膜制樣（噴金/噴碳）等處理后，通過冷凍傳輸系統放入電鏡內的冷臺（溫度可至-185℃）即可進行觀察。其中，快速冷凍技術可使水在低溫狀態下呈玻璃態，減少冰晶的產生，從而不影響樣品本身結構，冷凍傳輸系統保證在低溫狀態下對樣品進行電鏡觀察。對冷凍并固定在玻璃冰中的生物大分子進行成像，從而獲得蛋白質分子在各個方向上的投影。然后使用計算機處理和計算大量的2D（二維）圖像，并重建生物大分子的3D（三維）結構。

冷凍電鏡技術在生物學、材料科學等多個領域已經成為重要的研究工具。它通過超低溫冷凍和低劑量成像技術，有效地克服了傳統電子顯微鏡在觀察生物大分子和其他輻射敏感材料時的局限性。2015年，《自然》旗下子刊Nature Methods將冷凍電鏡技術評為年度最受關注的技術。2017年度的諾貝爾化學獎授予雅克·迪波什（Jacques Dubochet）、約阿基姆·弗蘭克（Joachim Frank）和理查德·亨德森（Richard Henderson），表彰他們在開發用于溶液中生物分子高分辨率結構測定的冷凍電鏡技術。

歷史沿革

幾十年來，電子顯微鏡一直是研究生物大分子結構的重要工具。隨著低溫和速凍技術的發展，冷凍電鏡技術應運而生，允許科學家在低溫下觀察樣品，以減少輻射損傷并保持生物大分子的自然狀態。

早期發展

1931年，德國物理學家馬克斯·諾爾（Max Knoll）和他的學生恩斯特·魯斯卡（Ernst Ruska）發明了第一臺透射電子顯微鏡，并于1933年首次突破了光學顯微鏡的極限，使得看到更小的粒子成為可能。電子顯微鏡成像需要在高真空下進行，電子對生物樣品的輻射損傷非常大。因此，在接下來的幾十年里，科學家們只能通過重金屬鹽染色來對生物樣本進行成像。

1968年，在劍橋大學MRC分子生物學實驗室里，阿隆·克魯格（Aron Klug）和他的學生德·羅西爾（De Rosier）在Nature上發表了一篇關于利用電子顯微鏡照片重構噬菌體病毒尾部三維結構的論文，提出并建立了電子顯微三維重構的一般概念和方法。阿隆·克魯格因此獲得1982年諾貝爾化學獎。1974年，加利福尼亞大學伯克利分校的羅伯特·格萊瑟（Robert Glaeser）和他學生肯·泰勒（Ken Taylor）首次提出冷凍電鏡，并測試了冷凍含水生物樣品的電鏡成像，目的在于降低高能電子對分子結構的損傷，并因此實現高分辨成像。

1975年，冷凍電鏡應用在“死”物質里如火如荼，但由于生物樣品的復雜性和結構的多樣性，強電子束、真空腔，這些環境使得生物樣品注定被破壞，使得冷凍電鏡在生物學領域被普遍認為“不適用”。然而，亨德森在菌紫紅質（bR，能吸收光能）上的嘗試，證明了電子顯微鏡在生物領域的適用性。之后，在阿隆·克魯格等人提出的三維重構技術的基礎上，亨德森和同事獲得了細菌視紫紅質較為粗糙的三維立體結構圖像。這也是歷史上第一張膜蛋白領域的三維結構。同年，阿希姆·弗蘭克（Joachim Frank）開始思考如何對電子顯微鏡獲得的二維平面模糊圖像進行分析和疊加處理，最終得到更高分辨率的三維立體圖像。

技術演進

1978年，雅克·迪波什（Jacques Dubochet）開始解決電子顯微鏡領域的樣品干涸并遭破壞的問題。迪波什得出的方法是對生物樣品進行玻璃化（vitrifying H?O）。一般情況下，通過氫鍵的相互作用，水分子會在凝固過程中形成有序排列，形成晶體。而迪波什想到的即是在水分子相互作用之前就讓其凝固，將生物樣品浸入事先經液氮冷卻的乙烷中，就能使水迅速冷卻、在數毫秒之內完全凝固，這種方式得到的就不是晶體而是無定形態，而玻璃也是處于無定形態，玻璃化名稱由此而來。生物樣品嵌在無定形冰中，堪稱留下了真實的一瞬間。

1981年，雅克·迪波什（Jacques Dubochet）和他的同事阿拉斯代爾·麥克道爾（Alasdair McDowall）在電子顯微鏡技術上取得了突破。他們介紹了快速冷凍的方法，它迅速將分子凍結在單層玻璃態水中，解決了高真空和輻射損傷的問題。同年，弗蘭克完成了一種算法，利用計算機識別圖像把相同蛋白質的不同影子收集起來，并且將輪廓相似的圖像進行分類對比，通過分析不同的重復模式將圖片擬合成更加清晰的2D圖像。在此基礎上，通過數學方法，在同一種蛋白質的不同2D圖像之間建立聯系，以此為基礎擬合出3D結構圖像。阿希姆·弗蘭克的圖形擬合程序被認為是冷凍電鏡發展的基礎。

1982年，雅克·迪波什開發出真正成熟可用的快速投入冷凍制樣技術制作不形成冰晶體的玻璃態冰包埋樣品。1984年，雅克·迪波什首次發布不同病毒的結構圖像。至此，相對容易地使用電子顯微鏡觀察生物大分子的要素基本集齊。1990年，亨德森再次對外發布了分辨率達到原子層面的菌紫紅質立體圖像，這一突破性成果有力證明了用電子顯微鏡進行生物分子成像的潛力。要實現原子分辨率，仍面臨許多挑戰。例如，電子顯微鏡圖像中的對比度和信噪比較低。此外，還需要將2D圖像轉換為3D結構。約阿基姆·弗蘭克（Joachim Frank）和他的同事馬林·范·海爾（Marin van Heel）率先使用計算圖像處理技術，計算和平均生物大分子的多個圖像副本，以提高信噪比。在獲得不同角度的2D圖像后，通過計算機軟件進行3D重建，以分析生物分子的3D結構。到1999年，大腸桿菌核糖體50S大亞基的分辨率已提高到7.5?。之后，直接電子探測器的引入極大地提高了成像的信噪比和數據采集速度，為冷凍電鏡技術的進一步發展奠定了基礎。

后續發展

在2000年后，電子顯微鏡結構的數量開始逐年增加，但分辨率并不高。2005年前后，冷凍電鏡技術解析的結構分辨率還較低，當時能做到的最好分辨率是利用高對稱病毒顆粒求解的7.4?，如果是大一點的配位化合物，譬如核糖體，則只能做到11.5?左右。當時電鏡照片的記錄載體是膠片或CCD（charged coupled device）。膠片比實時方便的CCD擁有更好的探測效率（detective quantumefficiency，簡稱DQE），但非常費時。人們迫切需要一個全新的、能高效率探測到電子（提升信噪比）同時還能方便快速實時的相機。來自加利福尼亞大學-圣地亞哥分校（UCSD）、伯克利國家實驗室（LBNL）和加利福尼亞大學爾灣分校（UCD）的聯合小組，以及劍橋大學MRC實驗室法魯吉（Farugi）和亨德森（Henderson）領導的小組都將目光轉向了直接電子探測器，并分別獨立發表了他們的工作。后來UCSD和UCI的小組開發了DE（direct electron）相機，MRC小組和FEI公司合作開發了Falcon相機，LBNL小組以及加州大學舊金山分校（UCSF）的大衛·阿加德（David Agard）教授則幫助Gatan公司開發了K2相機。2012年到2013年前后，這些直接電子探測器相機開始大范圍應用到冷凍電鏡領域中。相比較傳統光電耦合的CCD相機，直接電子探測器可以精準地計算出電子的位置來顯著地提高電鏡的圖像質量，而且能用類似電影的方式快速記錄電鏡圖像，從而幫助我們追蹤并矯正樣品漂移軌跡，同時還可以矯正輻射損傷。這些優勢都將冷凍電鏡的圖像質量提高到了一個全新的臺階，使冷凍電鏡的分辨率因此得到了極大的提高，并達到可以和X射線相媲美的程度。而且，冷凍電鏡技術不需要結晶，對樣品的質量和使用量也遠沒有晶體學需求的那么高，并且能利用三維分類等方法一次解出多種狀態的結構，引起了研究者的極大關注，因此，許多傳統晶體學研究組也開始轉向并大量應用冷凍電鏡技術。

2013年，加州大學舊金山分校（陳曉薇）程亦凡和大衛·朱利葉斯（David Julius）的研究組用冷凍電鏡首次得到膜蛋白TRPV1的3.4埃接近原子級別高分辨率三維結構，這一結果被視為具有里程碑意義。從這一年開始，冷通過電子顯微鏡分析的結構數量開始迅速提高，分辨率也提高到接近原子水平。在中國國內，冷凍電鏡方面的領軍人物是中國科學院院士、結構生物學家、清華大學副校長施一公，其關于剪切復合體的研究基本都利用了冷凍電鏡技術。2015年報道的β半乳糖苷酶的結構分辨率為2.2?。此外，20S蛋白酶體的分辨率和70S-EF-Tu復合體分別為2.8?和2.9?。2016年報道了冷凍電鏡得到的谷氨酸脫氫酶的3D結構（334 kDa），分辨率甚至達到1.8?。2018年，已有一些文章發表冷凍電鏡觀察的蛋白結構，分辨率均小于2?。

諾貝爾獎認可

2017年，諾貝爾化學獎授予了三位生物物理學家雅克·迪波什、約阿基姆·弗蘭克和理查德·亨德森，以表彰他們對冷凍電鏡發展的開創性貢獻。

工作原理

冷凍電鏡技術的基本原理是將生物大分子溶液置于電鏡載網上形成一層非常薄的水膜，然后利用快速冷凍技術將其瞬間冷凍至液氮溫度下。冷凍速度非常快，以至于水膜無法形成晶體，而是形成一層玻璃態的冰。生物大分子就被固定在這層薄冰里。將這樣的冷凍樣品保持低溫放置在透射電子顯微鏡下觀察，從而獲得生物大分子的結構，被稱為冷凍電鏡技術。

在透射電子顯微鏡下，高能電子束穿透每一個分子，如同X光穿過人的身體一樣，可以拍攝到分子的形貌和它內部的結構信息。科學家們利用計算機將樣本里的每一個分子提取出來，把相似的分子予以歸類，然后疊加、平均獲得其內部結構更為精細的圖像，由此得到分子不同方向的二維結構，最后經過計算機三維重構算法，可以得到分子的三維模型。這一過程被稱為冷凍電鏡三維重構解析。

如通過冷凍電鏡觀察懸浮脂質囊泡的薄水膜時，冷凍電鏡提供了薄層玻璃化樣品的圖像。由于玻璃化樣品對電子束相對透明，因此可以獲得懸浮在玻璃化基質中的物體的“透視圖”。通過使用物理固定（快速冷卻）作為冷凍電鏡唯一的固定方法，樣品保持化學未改性，從而提供懸浮材料的“真實視圖”。

用于透射電子冷凍顯微鏡的樣品通常通過將薄的水溶液膜迅速浸入液體冷卻劑中進行制備。為了確保樣品被埋入非晶態冰中而非晶態冰中，這些樣品的冷卻速率必須達到約10^4 K/s或更高。然而，由于如果與液氮（LN）接觸，烷烴會完全凍結；而如果將其與液氮隔離，烷烴的溫度會升高，可能導致冷卻速率、最終溫度或兩者都不足以產生非晶態冰，因此會出現困難。為了解決這一問題，通常需要重復冷卻或加熱步驟以確保適當的凍結條件。通常，乙烷（Et）或丙烷（Pr）會被冷卻，直到一小部分烷烴固化。樣品會凍結到固體數量增加到碰撞可能會造成樣品損壞為止，然后將冷卻氣體吹到固體上以融化它，之后可以繼續凍結更多樣品，并根據需要重復這一過程。

基本分類

冷凍電鏡技術的基本分類包括傳統冷凍電鏡、高壓冷凍電鏡、Cryo-FIB電鏡等。這些技術根據其應用和原理的不同，可以進一步細分為冷凍透射電鏡、冷凍掃描電鏡和冷凍蝕刻電鏡三種類型。

1、冷凍透射電鏡（Cryo-TEM）：這項技術通過在普通透射電鏡上加裝樣品冷凍裝置，將樣品冷卻到液氮溫度（77K），特別適用于觀察對溫度敏感的樣品，如蛋白質和生物切片。冷凍透射電鏡（Cryo-TEM）通過冷凍降低電子束對樣品的損傷，減小樣品形變，從而獲得更真實的樣品形貌。它具備高加速電壓、優良的電子光學性能、穩定的樣品臺和全自動操作等優點。

2、冷凍掃描電鏡（Cryo-sem）：這項技術在普通掃描電鏡上加裝低溫冷凍傳輸系統和冷凍樣品臺裝置，基于掃描電鏡技術發展而來。冷凍掃描電鏡（Cryo-SEM）允許直接觀察液體、半液體樣品，無需干燥處理，極大地減少了干燥過程對含水樣品的影響。其原理是使水在低溫下呈玻璃態，減少冰晶產生，獲得適合觀察的樣品。該技術具有防止樣品水分丟失、快速制樣和樣品可重復使用等優點。

3、冷凍蝕刻電鏡（Freezeetching）：一種結合斷裂和復型的制備透射電鏡樣品技術，能夠展示細胞和組織微細結構的立體構像。通過將樣品在干冰或液氮中冰凍，然后用冷刀劈開，真空中升溫至-100℃使斷裂面冰升華，暴露斷面結構，最終獲得可觀察的復膜。冷凍蝕刻電鏡具有使微細結構接近活體狀態、觀察不同劈裂面的微細結構、強立體感和耐受電子束轟擊及長期保存等優點。

方法

通過冷凍電子顯微鏡和三維重建的結合，在結構生物學領域取得了一系列重要突破。冷凍電鏡關鍵技術的突破主要來自于硬件和軟件的發展。硬件包括電子顯微鏡和圖像記錄裝置，軟件包括3D重建算法和圖像數據處理。

樣品制備

樣品制備的正確性是冷凍電鏡獲得可靠分析結果的重要前提，因為它決定了成像和分析樣品的質量。首先，微柵上的顆粒應分散、隨機取向、薄且無污染。每個制樣步驟都可能對抽樣質量產生重大影響，如pH值、緩沖溶液等因素。對于生物大分子，通常采用印跡法和冷凍玻璃化法制備樣品，這種方法能很好地保留樣品的原始結構，通過快速玻璃化將偽影降到最低，并且在操作得當時能提供一致的結果。該方法非常適合液態樣品或能均勻分散到液體中的樣品。然而，實現最佳玻璃化厚度是一項挑戰，樣品厚度的變化可能會影響所獲圖像的質量。處理較大或較厚的樣品時，該方法也會遇到困難，因為要在整個微柵上形成玻璃狀薄冰層會受到限制。如果感興趣的樣品較大、埋在大塊中或要求特定的取向，則建議使用聚焦離子束（FIB）。為減少銑削過程中的束流損傷，可以考慮采用低溫處理。盡管這種方法有效，但即使在低溫條件下也難以避免光束損傷。此外，它還具有成本高、耗時長和整體復雜性高等特點。另一種方法是在微柵上手動分散樣品，或通過原位生長，如在微柵上電化學鍍鋰（Li）/ 鈉（Na）金屬。如果樣品對空氣敏感，則需要專門設計的支架或容器來處理和轉移樣品，以免暴露在空氣中。這些方法的選擇取決于實施的難易程度、可重復性和具體要求等因素，因此需要根據樣品的性質和冷凍電鏡的預期結果做出明智的選擇。

數據分析

冷凍電鏡在成像上擁有更高的分辨率，已經獲得了一系列新的、有吸引力的近原子分辨率結構，充分證明了這一點。例如，病原體核糖體和藥物分子的復雜結構，線粒體核糖體的大亞基結構，哺乳動物核糖體配位化合物的結構，以及TRPV1離子通道的結構。冷凍電鏡采用新型直接電子探測器，比傳統介質（CCD相機或攝影膠片）更靈敏、更快速，可以以每秒多幀的速率記錄圖像數據，而不是單次長時間曝光。直接電子檢測相機不僅在檢測量子效率上有了顯著的提高，而且具有高幀率，使圖像能夠作為由堆疊幀構成的“電影”進行采集。未來，對更高分辨率的渴望必將在許多方面推動電子顯微鏡的發展：更薄的探測器芯片和更快的讀出率，從而大大提高分辨率的信噪比；改進樣品制備方法，使用在電子轟擊下不易移動的支架；開發新的圖像記錄程序，以減少由光束引起的樣品移動。此外，冷凍電鏡中如Titan Krios，300kV場發射低溫透射電子顯微鏡，配備場發射電子槍和三級聚光鏡系統，可在一定照明范圍內實現平行照明，擁有恒功率模式磁性鏡頭系統，確保成像高穩定性的，其點分辨率可達0.25nm，信息分辨率極限可達0.14nm。

數據處理

廣泛使用的電鏡分析軟件系統主要包括SPIDER（蛛網），EMAN2（電子顯微鏡分析網絡2），FRE ALIGN（自由對齊），SPARX（星光），RELION（重力離子）等。低信噪比或圖像對比度差是冷凍電子鏡的主要挑戰，由于生物樣品對輻射敏感，因此很難避免。它只能通過減少電子劑量來改善，這反過來又導致非常低的信噪比。新型直接電子探測器的發展和應用，極大地推動了圖像處理和算法的發展。為了從嘈雜的圖像中提取有價值的結構信息，研究人員開發了一種基于未確定結構的最大可能和先驗信息的組裝體。這款新軟件在很大程度上可以在沒有用戶干預的情況下運行，并提供客觀的分辨率標準，迅速成為冷凍電子顯微鏡的“黃金標準”。新的標準化驗證程序使結果（包括顆粒取向、絕對手性和對比度損失）更加可靠，并且可以避免過度擬合噪聲，以生成更清晰的圖像。強大的分類方法可以分離出不同的分子或同一分子在同一視野中的不同結構狀態。因此，新算法的發展和進步使人們對樣品處理有了新的認識：樣品在計算機中純化，而不是通過艱巨、耗時且往往具有破壞性的生化過程。

應用領域

生物學

冷凍電鏡在生物學研究中扮演著關鍵角色，其應用涵蓋了多個重要領域。它能夠高分辨率地解析剪接體和染色體等基因表達和調控相關配位化合物的結構，揭示了這些復合物在mRNA加工中的作用機制。冷凍電鏡還用于研究蛋白質合成和降解相關的核糖體和蛋白酶體，幫助了解它們在蛋白質合成和降解過程中的功能。對于膜蛋白，由于其在藥物靶點中的重要性且難以通過傳統X射線晶體學解析，冷凍電鏡提供了關鍵的結構信息。同時，它也用于解析病毒顆粒及其相關蛋白質復合物的結構，從而有助于理解病毒的自組裝和感染機制，并為藥物設計提供結構基礎。在神經退行性疾病方面，冷凍電鏡能夠揭示相關蛋白質的結構，例如ATP酶四聚體，為治療這些疾病提供了結構基礎。它還對先天免疫系統中的蛋白質，如炎癥小體和TCR-CD3復合物，提供了重要的結構信息，有助于理解免疫反應及其相關疾病的機制。

材料科學

冷凍電鏡在材料科學中的應用涵蓋了鋰電池材料、聚合物以及金屬有機骨架（MOF）。對于鋰離子電池，冷凍電鏡能夠研究正極、負極、電解質等組件之間的界面及其納米結構變化。聚合物領域中，冷凍電鏡提供了一種避免傳統電鏡破壞的表征方法，能夠分析無機化合物納米顆粒對固體聚合物電解質的影響，并揭示聚合物與無機填料界面的元素分布。在金屬有機骨架（MOF）的研究中，冷凍電鏡用于觀察MOF顆粒的晶體結構及其亞穩態結構，分析晶體缺陷對氣體存儲和傳輸的影響，以及客體分子對MOF骨架的相互作用，這些研究為理解和應用MOF材料提供了重要的信息。

參考資料 >

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Renewables | 中國科學院物理研究所王雪鋒：將冷凍電鏡從生物學擴展到材料科學.澎湃新聞.2024-07-19

漲知識丨冷凍電鏡是什么？為什么能夠斬獲今年諾貝爾化學獎？.澎湃新聞.2024-07-20

《崔屹最新science:玩轉冷凍電鏡——揭密電池材料和界面原子結構》.中國科學院文獻情報中心.2025-06-30

2017年諾貝爾化學獎：三位生物物理學家因冷凍電鏡技術獲獎.cdstm.2024-08-23

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冷凍電子顯微鏡技術的發展、應用與前景.ncbi.2024-08-06

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冷凍電鏡技術:給生物化學帶來革命性變化.漯河市人民政府.2024-08-29

【人民日報海外版】冷凍電鏡成功解析大腦神經突觸.中國科學技術大學新聞網.2025-06-09