雙縮脲[niào]試劑是一種用于鑒定蛋白質(zhì)的分析化學試劑。它是一種堿性的含銅試液，呈藍色，由0.1 g/mL氫氧化鈉或氫氧化鉀、0.01 g/mL硫酸銅和酒石酸鉀鈉配制而成。
雙縮脲試劑本是用來檢測雙縮脲，由于蛋白質(zhì)分子中含有很多與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此也能與銅離子在堿性溶液中發(fā)生雙縮脲反應。當底物中含有肽鍵時，試液中的銅與多肽配位，配位化合物呈紫色?？赏ㄟ^比色法分析濃度，在紫外可見光譜中的波長為540nm。鑒定反應的靈敏度為5-160mg/mL。
雙縮脲試劑中真正起作用的是硫酸銅，而氫氧化鉀僅僅是為了提供堿性環(huán)境，因此它可被其他堿，如氫氧化鈉所代替。向試劑中加入碘化鉀，會延長試劑的使用壽命。酒石酸鉀鈉的作用是保護反應生成的配位化合物不被析出變?yōu)槌恋?，從而使試劑失效?/p>
簡介
血清蛋白測定(雙縮脲法)試劑：球蛋白沉淀劑同上頁酚試劑法。雙縮脲試劑：硫酸銅(CuSO4·5H2O,三級試劑)1.5克，酒石酸鉀鈉(KNaC4H生O6·4H2O,三級試劑)6.0克2.5N氫氧化鈉，300毫升，蒸餾水。將硫酸銅及酒石酸分別各以200毫升蒸餾水溶解，必要時過濾，全部傾入1,000毫升容量瓶中，混勻。再加入氫氧化鈉并以蒸餾水稀釋至1,000毫升刻度。分裝塑料或內(nèi)壁涂蠟的試劑瓶，加塞密封，于室溫保存。若溶液中出現(xiàn)栗色沉淀即不宜再用。
反應原理
需要注意的是，能與雙縮脲試劑發(fā)生紫色反應的化合物分子中至少含有兩個肽鍵。因此，二肽無法用它來檢驗。
配制
雙縮脲試劑A是質(zhì)量分數(shù)為0.1g/mL的NaOH水溶液；
雙縮脲試劑B是質(zhì)量分數(shù)為0.01g/mL的CuSO4水溶液。
先在待測液中加入雙縮脲試劑A 3mL，振蕩均勻（營造堿性環(huán)境），再加入1～2滴雙縮脲試劑B，振蕩均勻。如果待測液里含有蛋白質(zhì)，那么會看到溶液變成紫色。具有兩個或兩個以上肽鍵的化合物皆可與雙縮脲試劑產(chǎn)生紫色反應。
蛋白質(zhì)的肽鍵在堿性溶液中能與Cu2+絡合成紫色的配位化合物。顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。
解釋
雙縮脲試劑是由雙縮脲試劑A和雙縮脲試劑B兩種試劑組成.
具體方法是
先將雙縮脲試劑A加入組織樣液，搖蕩均勻，在加入雙縮脲試劑B，搖蕩均勻。如果組織里含有蛋白質(zhì)，那么會看到溶液變成紫色。
應用
雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩?個分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應。
H2O
O=C?C=O
HN?NH
R-CH?CH-R
O=C?Cu?C=O
HN?NH
R-CH?CH-R
H2O
試劑作用
雙縮脲試劑可以驗證蛋白質(zhì)的存在。
具體方法是：
先將雙縮脲試劑A加入組織樣液，振蕩均勻（必須營造堿性環(huán)境），再加入雙縮脲試劑B，振蕩均勻。如果組織里含有蛋白質(zhì)，那么會看到溶液變成紫色。具有兩個或兩個以上肽鍵的化合物皆可與雙縮脲試劑產(chǎn)生紫色反應。蛋白質(zhì)的肽鍵在堿性溶液中能與Cu2+絡合成紫紅色的配位化合物。顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。
雙縮脲（NH2CONHCONH2）是兩個分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。
雙縮脲試劑本是用來檢測雙縮脲，因蛋白質(zhì)中也有-CONH-基也可用于檢驗蛋白質(zhì)，與蛋白質(zhì)接觸后的顏色呈紫色。
與雙縮脲區(qū)別
雙縮脲（NH2CONHCONH2）是兩個分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。
雙縮脲試劑是由雙縮脲試劑A和雙縮脲試劑B兩種試劑組成
雙縮脲試劑A的成分是氫氧化鈉的質(zhì)量分數(shù)為0.1 g/mL的水溶液；
雙縮脲試劑B的成分是硫酸銅的質(zhì)量分數(shù)為0.01 g/mL的水溶液。
雙縮脲試劑可以驗證蛋白質(zhì)的存在，遇蛋白質(zhì)產(chǎn)生紫色。
簡單的說，雙縮脲是一種物質(zhì)，而檢測蛋白質(zhì)用的那兩個試劑之所以叫雙縮脲試劑，是因為檢測原理和雙縮脲的形成相似。
方法學評價
雙縮脲（NH2CONHCONH2）是兩個分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物，在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色配位化合物，雙縮脲反應產(chǎn)生的紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。
優(yōu)點：雙縮脲法測定蛋白質(zhì)的測定范圍是1~10mg蛋白質(zhì)，操作簡單、快捷。既適合手工操作，又適合自動化分析，重復性好、線性關系好，雙縮脲試劑可以長期保存（若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制）。
缺點：靈敏度差，測定范圍窄，樣品需要量大，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，因此它常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。干擾測定的物質(zhì)包括有：在性質(zhì)上是氨基酸或肽的緩沖液，如三羥甲基氨基甲烷緩沖液，因為它們產(chǎn)生陽性呈色反應，銅離子也容易被還原，有時出現(xiàn)紅色沉淀。
注意事項
在使用雙縮脲試劑時候，必須注意，必須是先加0.1?g/mL氫氧化鈉，再加0.01?g/mL硫酸
銅的水溶液。(若先加入硫酸銅CuSO?溶液，再加入氫氧化鈉NaOH溶液，則無法充分制造堿性環(huán)境，此時CuSO?會與NaOH發(fā)生復分解反應，生成藍色氫氧化銅Cu(OH)?沉淀，導致現(xiàn)象不清，無法較好地達到實驗目的。
參考資料 >