氧化硫硫桿菌是細菌冶金的一種重要細菌，是一種具有代表性的極端嗜酸性嚴(yán)格自養(yǎng)細菌，它能氧化元素硫和還原性的硫化合物，以CO_2作為主要碳源而生長，是一種嚴(yán)格好氧的專性自養(yǎng)化能無機化合物營養(yǎng)細菌。氧化硫硫桿菌缺乏EMP、ED途徑以及TCA循環(huán)中的關(guān)鍵酶—磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖酸脫水酶、特征性酶2--3-脫氧-6-磷酸葡萄糖醛縮酶以及α-酮戊二酸脫氫酶等不能以有機質(zhì)作為能源和碳源。只能通過固定CO_2獲得碳源，從無機物的氧化獲得能源，而無機物的氧化還原電位較高，可供這些細菌生長利用的能量很少，所以這類細菌往往生長緩慢，代時長，細胞得率低。
基本介紹
細菌冶金是濕法冶金新的研究領(lǐng)域和方向,目前已在銅、、金的提取方面獲得了成功應(yīng)用。幾乎所有的硫化礦都可用細菌提取其中的有價金屬。且細菌冶金技術(shù)因其投資小、成本低、能耗少、工藝流程簡單和對環(huán)境友好等特點,已成為21 世紀(jì)資源處理的主要工藝技術(shù). 目前使用較多的浸礦菌種除氧化亞鐵硫桿菌( 硫桿菌屬 鐵2oxidans, T. f) 外還有氧化硫硫桿菌( Thiobacillusth iooxidans, T. t). 氧化硫硫桿菌是一種化能自養(yǎng)菌,專性好氧,嗜酸,革蘭氏染色陰性,呈桿狀,寬0. 3～0. 5μm,長1. 0～2. 0μm. 氧化硫硫桿菌以氧化單質(zhì)硫或還原態(tài)的硫化物來獲得自身細胞生長和代謝所需要的能量,以NH+4 為氮源,以空氣中CO2 為碳源。 因為生長環(huán)境的差異,不同地域的氧化硫硫桿菌之間必然存在著差異,因此,須根據(jù)不同的浸礦要求分離不同的氧化硫硫桿菌菌株. 本文就是根據(jù)某礦浸礦的要求,去分離、純化和培養(yǎng)一株氧化硫硫桿菌菌株。
材料和方法
1 水樣采集
水樣取自某礦礦坑。取樣方法如下:先將用牛皮紙扎好的取樣瓶與取樣勺用高壓滅菌器高壓滅菌,在取樣點打開牛皮紙,用酒精燈燒灼瓶口,舀取水樣至取樣瓶三分之二處,迅速扎好牛皮紙帶回。
2 培養(yǎng)基的配制
液體培養(yǎng)基采用Starky - Na2 S2臭氧 培養(yǎng)基和Waksman 培養(yǎng)基。 固體培養(yǎng)基采用Starky -Na2 S2O3 - 瓊脂培養(yǎng)基。
3 水樣處理
考慮到水樣的pH值在2. 5 左右,適合氧化硫硫桿菌的生長,細菌數(shù)目較多,所以將水樣倍比稀釋1 000倍。
4 細菌分離
取稀釋后的水樣10 mL加入到90 mL Starky- Na2 S2O3 培養(yǎng)基中,置恒溫水浴搖床培養(yǎng),溫度設(shè)定為30℃,轉(zhuǎn)速設(shè)定為200 r /min。待菌液pH值達到1. 0左右時,取5 mL菌液加入到95 mL新的培養(yǎng)基中。如此反復(fù)進行5次。
5 細菌純化
在事先用紫外線滅菌的潔凈操作工作臺中,取10μL培養(yǎng)好的菌液加入到固體培養(yǎng)基上,再用滅菌的涂菌器將菌液涂布均勻。將培養(yǎng)皿正置室溫2 h后轉(zhuǎn)到30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。
6 單克隆挑選與培養(yǎng)
用滅菌的10 μL tip 頭從培養(yǎng)皿表面挑取形態(tài)規(guī)則,大小適中的單個菌落轉(zhuǎn)到液體培養(yǎng)基中,置30℃水浴搖床中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)速設(shè)置為200 r /min。待菌液pH值達到1. 0左右時,取5 mL菌液加入到95 mL 新的培養(yǎng)基中(同時接種到Starky -Na2 S2臭氧 培養(yǎng)基和Waksman培養(yǎng)基中)。如此反復(fù)進行5次。最后一次培養(yǎng)時,每天測定pH值,當(dāng)pH值達到1. 0左右時用血球計數(shù)板計數(shù)細菌量。
實驗結(jié)果
1 細菌分離
培養(yǎng)時每天測定pH值,到第7天時pH值達到了1. 0. 染色后鏡檢發(fā)現(xiàn)視野下有較多行動活躍的桿菌。
2 細菌純化
培養(yǎng)進行到第12天可以看到培養(yǎng)皿上有針尖大小的菌落,到第20天可以看到菌落直徑長至1 mm左右,呈綠色。
3 克隆挑選
挑選單克隆轉(zhuǎn)到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),每天測pH值,其中pH值變化最快的一株菌株變化情況使用血球計數(shù)板計數(shù),氧化硫硫桿菌的數(shù)量都達到了每毫升107 個。
總結(jié)
關(guān)于能在礦坑水和礦體土壤中生存的細菌已有不少的報道。目前用人工合成培養(yǎng)基已經(jīng)分離培養(yǎng)了許多新菌種,這些新菌種被推廣和應(yīng)用到生產(chǎn)過程中,產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。
用于礦物浸出的微生物多為化能自養(yǎng)菌,在繁殖和生長過程中,不要求任何有機化合物,純粹靠無機化合物為能量來源。 對于某些細菌,比如氧化亞鐵硫桿菌,一些有機物的存在還會抑制其生長。 這些浸礦細菌有著一些共同的特點:它們能在普通微生物所不能生存的強酸性礦坑水中生存,革蘭氏染色為陰性,活動能力較強,通過直接作用和間接作用浸出礦石。
氧化硫硫桿菌作為浸礦細菌的一種,生長過程中也不需要有機物,它能通過對硫及其化合物的氧化獲得生長和繁殖必須的能量。同時,在這個過程中會產(chǎn)生硫酸和能溶于酸性介質(zhì)的金屬元素,達到加快浸礦速度,減少酸耗,從而降低生產(chǎn)成本的作用。并且,它在對貧礦和尾礦的處理上有其獨特的優(yōu)勢。 所以,選育生長能力強,氧化性能好的氧化硫硫桿菌具有重要的意義。
本研究中我們使用了Starky - Na2 S2臭氧 培養(yǎng)基和Waksman培養(yǎng)基,研究發(fā)現(xiàn),氧化硫硫桿菌在使用Na2 S2O3 做能源時, pH值呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,我們認為這是因為在氧化硫硫桿菌生長的初期,它在溶液中發(fā)生緩慢的歧化反應(yīng),生成亞硫酸鈉和硫,這兩者都是氧化硫硫桿菌極易利用的還原性物質(zhì)。同時,硫代硫酸鈉和亞硫酸鈉的水解釋放出OH- ,使溶液的pH緩慢上升。在經(jīng)過7天的遲緩期,隨著氧化硫硫桿菌進入對數(shù)生長期,才開始發(fā)揮其對硫和還原性含硫化合物的卓著的氧化作用能力而開始產(chǎn)生大量硫酸,使pH值大幅下降。 此過程可以用以下反應(yīng)式表示:2S + 3O2 + 2H2O→2H2 SO4
而使用硫做底物時, pH值先是緩慢下降7天左右,然后開始迅速下降. 我們認為主要是培養(yǎng)初期細菌數(shù)量較少,當(dāng)生長7天后,細菌進入對數(shù)生長期,細菌數(shù)量迅速增加,產(chǎn)生的硫酸相應(yīng)增多,引起pH值迅速降低. 所以這兩種培養(yǎng)基都可以用于氧化硫硫桿菌的培養(yǎng),但是如果使用氧化硫硫桿菌浸礦時,由于它在Waksman培養(yǎng)基中生長時,沒有pH值上升的過程, pH值下降更迅速,更有利于浸礦反應(yīng)。
參考資料 >