免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測定的一項(xiàng)新技術(shù)。
它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微鏡（包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡）的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測各種抗原物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等）。免疫組化技術(shù)近年來得到迅速發(fā)展。50年代還僅限于免疫熒光技術(shù)，50年代以后逐漸發(fā)展建立起高度敏感，且更為實(shí)用的免疫酶技術(shù)。
定義
免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)。
主要過程
免疫組織化學(xué)的全過程包括：
1.抗原的提取與純化；
2.免疫動(dòng)物或細(xì)胞融合，制備特異性抗體（免疫球蛋白）以及抗體的純化；
3.將顯色劑與抗體結(jié)合形成標(biāo)記抗體；
4.標(biāo)本的制備；
5.免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)以及呈色反應(yīng)；
6.觀察結(jié)果。
應(yīng)用基本原則
免疫組織化學(xué)染色在生物醫(yī)學(xué)研究中具有十分廣泛的作用。并且涉及許多研究領(lǐng)域。但是，免疫組織化學(xué)技術(shù)也有其局限性，例如，組織細(xì)胞內(nèi)的待測物質(zhì)要有反應(yīng)原性，而且需要有一定濃度方可檢出；檢出的免疫反應(yīng)陽性蛋白不能被確定是細(xì)胞新合成的蛋白還是通過細(xì)胞間運(yùn)輸而來的蛋白，因此，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中應(yīng)充分考慮這些特點(diǎn)。如果實(shí)驗(yàn)需要證明已知蛋白為何種細(xì)胞合成，需采用分子原位雜交技術(shù)解決。為引導(dǎo)初學(xué)者在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中合理巧妙地運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)，將其應(yīng)用的基本原則簡述如下：
1．確定細(xì)胞類型和形態(tài)。組織細(xì)胞內(nèi)有些蛋白具有組織特異性，如膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（gial fibrillary acidic protein，GFAP）只存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)．神經(jīng)絲蛋白（Neurofilament，NF）只存在于神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)。通常把這些具有組織特異性的蛋白稱為標(biāo)記性蛋白（Proteiniliaker）。通過標(biāo)記性蛋白的特異性抗體可確定細(xì)胞種類。有些細(xì)胞（如表皮內(nèi)朗格漢斯細(xì)胞和黑色素細(xì)胞等）在光鏡下不易辨認(rèn)，通過對胞質(zhì)內(nèi)的特定蛋白實(shí)施免疫組化染色，便能清楚顯示此類細(xì)胞外形輪廓。這種作用在神經(jīng)科學(xué)研究和腫瘤臨床病理中顯得尤為重要。
2．辨認(rèn)細(xì)胞產(chǎn)物的來源。利用某些細(xì)胞產(chǎn)物為抗原，制備相應(yīng)的抗體，對組織細(xì)胞實(shí)施免疫組織化學(xué)染色，以確定細(xì)胞產(chǎn)物的來源。如內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生的各種激素，大多數(shù)可用免疫組化染色技術(shù)辨認(rèn)，據(jù)此可研究細(xì)胞的分泌功能及對內(nèi)分泌腫瘤作功能分類，檢測分泌異位激素的腫瘤等，了解細(xì)胞分化程度。
3．確定細(xì)胞的分化程度。不同的同一類細(xì)胞多表達(dá)不同的標(biāo)志性蛋白，根據(jù)對這些不同蛋白的鑒定可確定細(xì)胞的分化程度。例如，神經(jīng)上皮細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白是巢蛋白（nestin），當(dāng)其分化為放射狀膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)表達(dá)波形蛋白（vimentin）。在神經(jīng)元發(fā)生期分化為成神經(jīng)細(xì)胞時(shí)則表達(dá)Ⅲβ神經(jīng)微管蛋白（TUJl），成神經(jīng)細(xì)胞分化為成熟的神經(jīng)元時(shí)表達(dá)神經(jīng)絲蛋白（neurofilament，NF）。
4．追蹤神經(jīng)纖維束和它的投射區(qū)。用于此目的的免疫組織化學(xué)方法常與軸漿運(yùn)輸示蹤法相結(jié)合來研究神經(jīng)元之間的聯(lián)系。軸漿運(yùn)輸示蹤法是利用某些物質(zhì)可被神經(jīng)末梢攝取。經(jīng)軸質(zhì)逆行運(yùn)輸?shù)桨w的特點(diǎn)．用組織化學(xué)方法顯示出神經(jīng)元的輪廓。常用示蹤劑有辣根過氧化物酶和熒光金等。例如。為觀察周圍神經(jīng)系統(tǒng)或中樞神經(jīng)系統(tǒng)某核團(tuán)神經(jīng)纖維投射．先將示蹤劑注射到動(dòng)物神經(jīng)纖維末梢部位，使動(dòng)物存活一段時(shí)間，在預(yù)期神經(jīng)纖維投射部位取材，先通過組織化學(xué)方法使示蹤劑定位，再實(shí)施免疫組織化學(xué)方法確定其性質(zhì)。
5．在臨床病理中的應(yīng)用。如鑒定病變性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)微小病灶，探討腫瘤起源或分化表型，確定腫瘤分期，指導(dǎo)治療和預(yù)后。輔助疾病診斷和分類，尋找感染病因等。
相關(guān)操作
儀器設(shè)備
1）18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫(yī)用微波爐；
2）水浴鍋
試劑
1）PBS緩沖液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，氯化鉀 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。
2）0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液（CB，pH6.0，1000ml）：枸櫞酸三鈉 3g，檸檬酸 0.4g。
3）0.5mol/L 乙二胺四乙酸二鈉緩沖液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L 氫氧化鈉調(diào)至pH8.0,加水至1000ml。
4）1mol/L的TBS緩沖液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris堿，用1N的HCl調(diào)至pH8.0,加水至1000ml。
5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6）3%甲醇-過氧化氫溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
7）封裱劑：
a、丙三醇和0.5mmol/L碳酸根緩沖液（pH9.0～9.5）等量混合；
b、油和TBS(或pbs)配制。
8）TBS/PBS pH9.0～9.5，適用于熒光顯微鏡標(biāo)本；pH7.0～7.4適合于光學(xué)顯微鏡標(biāo)本。
操作流程
1、脫蠟和水化
脫蠟前，應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘焙20分鐘。
1）組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10分鐘；
2）乙醇中浸泡5分鐘；
3）95%乙醇中浸泡5分鐘；
4）70%乙醇中浸泡5分鐘；
2、抗原修復(fù)
1）抗原熱修復(fù)
（1）高壓熱修復(fù) 在沸水中加入乙二胺四乙酸二鈉（pH8.0）或0.01M枸酸鈉緩沖溶液（pH6.0）。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進(jìn)行鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會(huì)升起來。10分鐘后，去除熱源，置入涼水中，當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。本方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復(fù)。
（2）煮沸熱修復(fù) 電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至95℃左右，放入組織芯片加熱10~15分鐘。
（3）微波熱修復(fù) 在微波爐里加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5~10分鐘，反復(fù)1-2次。適用的抗原有：AR，BAX，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，周期蛋白，ER，Heat shock protein，人類乳頭瘤病毒，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預(yù)熱至37℃，切片也預(yù)熱至37℃，消化時(shí)間約為5~30分鐘；胃蛋白酶消化37℃時(shí)間為30分鐘。適用于被固定遮避的抗原，其中有：膠原蛋白，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
3、免疫組織化學(xué)染色
SP法
1）脫蠟、水化；
2）pbs洗2～3次各5分鐘；
3）3%過氧化氫（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘；
4）PBS洗2～3次各5分鐘；
5）抗原修復(fù)；
6）PBS洗2～3次各5分鐘；
7）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。
8）滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1小時(shí)或者4℃過夜或者37℃1小時(shí)。
9）4℃過夜后需在37℃復(fù)溫45分鐘。
10）PBS洗3次各5分鐘；
11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室溫靜置，或37℃1小時(shí)；
12）II抗中可加入0.05%的tween-20。
13）pbs洗3次各5分鐘；
14）DAB顯色5～10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；
15）PBS或自來水沖洗10分鐘；
17）自來水沖洗10～15分鐘；
18）脫水、透明、封片、鏡檢。
SABC法
1)脫蠟、水化。
2)PBS洗兩次各5分鐘。
3)用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%過氧化氫，室溫封閉5～10分鐘，蒸餾水洗3次。
4)抗原修復(fù)。
5)PBS洗5分鐘。
6)滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。
7)滴加Ⅰ抗，室溫1小時(shí)或者4℃過夜或者37℃1小時(shí)（4℃過夜后在37℃復(fù)溫45分鐘）。
8)pbs洗三次每次2分鐘。
9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分鐘。
10)PBS洗3次每次2分鐘。
11)滴加試劑SABC，20℃～37℃20分鐘。
12)PBS洗4次每次5分鐘。
13)DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。
15)脫水、透明、封片、鏡檢。
常見問題
免疫組化實(shí)驗(yàn)所用的抗體
免疫組化實(shí)驗(yàn)中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體。單克隆抗體是一個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆分泌的抗體，應(yīng)用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動(dòng)物制備。多克隆抗體是將純化后的抗原直接免疫動(dòng)物后，從動(dòng)物血中所獲得的免疫血清，是多個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。
免疫組化實(shí)驗(yàn)所用的組織和細(xì)胞標(biāo)本
實(shí)驗(yàn)所用主要為組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法，對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供病例對照研究；石蠟切片制作過程對組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進(jìn)行抗原修復(fù)，是免疫組化中首選的組織標(biāo)本制作方法。
石蠟切片的抗原修復(fù)及方法
石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定，使得細(xì)胞內(nèi)抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇，同時(shí)蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。所以要求在進(jìn)行IHC染色時(shí)，需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露，即將固定時(shí)分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。
常用的抗原修復(fù)方法有微波修復(fù)法，高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復(fù)液是pH6.0的0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。
常用染色方法
根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標(biāo)法，親和組織化學(xué)法，后者是以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)的檢測方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗體)在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。
抗體反應(yīng)
交叉反應(yīng)原因
指抗體除與其相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性反應(yīng)外還與其它抗原發(fā)生反應(yīng)。產(chǎn)生的原因有以下幾個(gè)方面：
1. 抗原特異性指用于免疫動(dòng)物的反應(yīng)原性物質(zhì)中含有多種抗原分子，它引起動(dòng)物產(chǎn)生針對多種抗原分子特異性的相應(yīng)抗體。任何其它物質(zhì)只要含有一種或多種與上述物質(zhì)相同的抗原分子，必將與上述多特異性的抗血清發(fā)生交叉反應(yīng)。
2. 共同決定簇即兩種抗原分子中都含有相同的抗原決定簇。
3. 決定簇相似，兩種不同的抗原決定簇，如果結(jié)構(gòu)大致相同，由于空間構(gòu)象關(guān)系，某一決定簇的相應(yīng)抗體可以與大致相同的決定簇發(fā)生交叉反應(yīng)。當(dāng)然抗原一抗體之間構(gòu)象相似時(shí)的結(jié)合力小于吻合時(shí)的結(jié)合力。
多抗和單抗特性比較
1.均一性。一種單抗中，每個(gè)抗體的化學(xué)結(jié)構(gòu)和氨基酸順序都相同，只有一種Ig亞類。即單抗是一種純度很高的均一抗體。而從不同動(dòng)物，不同時(shí)期所得到的多抗，各有不同的化學(xué)組成。多抗是多種種類和亞類Ig的混合物。
2. 穩(wěn)定性。單抗的穩(wěn)定較差，對PH變化敏感，對熱不穩(wěn)定，提純過程中易變性，而多抗的穩(wěn)定性則較好。
3. 特異性。單抗是單一地針對抗原的某一決定簇，所以用它進(jìn)行血清學(xué)反應(yīng)時(shí)，特異性強(qiáng)，敏感性高，一般不發(fā)生交叉反應(yīng)。而多抗能與抗原上的多種抗原決定簇結(jié)合，所以特異性較差，較易引起交叉反應(yīng)。
4.重復(fù)性。單抗的重復(fù)性好，而多抗每批都不一樣。
5. 沉淀反應(yīng)。多抗由于與抗原多價(jià)結(jié)合容易形成網(wǎng)絡(luò)樣沉淀，而單抗只與抗原結(jié)合產(chǎn)生二聚體，不能直接形成抗原抗體沉淀物。
抗體保存
抗體儲存容器應(yīng)由不吸附蛋白質(zhì)的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如儲存的抗體中蛋白濃度很低（10-100mg/L），就應(yīng)另加隔離蛋白以減少容器對抗體蛋白的吸附，隔離蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。絕大多數(shù)已稀釋的抗體應(yīng)存在4℃-8℃條件下，以免凍融對抗體蛋白產(chǎn)生有害效應(yīng)。
抗體原液和已分離的免疫球蛋白組分應(yīng)保存于-20℃條件下，并避免反復(fù)凍融。冷凍的抗體溶液應(yīng)置于室溫中緩慢地解凍，應(yīng)絕對避免用高溫快速解凍。被細(xì)菌污染的抗體常會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果，應(yīng)將污染的抗體溶液及其他試劑棄之。為防止細(xì)菌污染，可于抗體溶液中加入0.01%疊氮鈉。
抗體經(jīng)FD食品后置-20℃以下可保存3-5年。保存稀釋后的單抗應(yīng)加入0.1%疊氮鈉濃度。大多數(shù)稀釋抗體可進(jìn)行冷凍保存，少數(shù)抗體可能會(huì)丟失抗原活性。大多數(shù)單抗，只要蛋白濃度適當(dāng)，可在4℃下保存數(shù)月。
參考資料 >