球形芽孢桿菌是一種在自然界中廣泛分布、形成亞末端膨大孢子囊和球形芽孢的好氣芽孢桿菌。在已發(fā)現(xiàn)的49個(gè)鞭毛血清型中有9個(gè)血清型(H1、H2、H3、H5、H6、H9、H25、H26和H48)的菌株對(duì)蚊幼蟲(chóng)有一定的毒殺作用。其中大部分高毒力菌株屬血清型H5、H6和H25，如2362、1593、2297、Ts-1和C3-41等[6～11]。根據(jù)其殺蚊活性，這些菌株分為高毒力菌株和低毒力菌株，所有有毒菌株都具有較高的脫氧核糖核酸同源性（>79%），屬DNA同源型IIA型。
殺蚊機(jī)理
蘇云金芽孢桿菌以色列亞種(Bti)和球形芽孢桿菌(Bs)是目前應(yīng)用最廣、使用最成功的滅蚊病原微生物，其滅蚊選擇性強(qiáng)，對(duì)非靶生物和人畜無(wú)毒性，在自然界中易降解不污染環(huán)境。養(yǎng)殖場(chǎng)滅蚊范圍廣，排污量大，積水容器多，易生多種蚊類(lèi)，使用Bti制劑和Bs制劑具有施藥方便、作用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，能有效控制蚊蟲(chóng)的孳生。
球形芽孢桿菌(芽孢桿菌屬 sphaericus，Bs) 與蘇云金芽孢桿菌相比較，球形芽孢桿菌的殺蚊譜較窄，其中對(duì)庫(kù)蚊屬幼蟲(chóng)的毒性最強(qiáng)，在污水中的藥效維持時(shí)間較長(zhǎng)，特別適用于污水中孳生的庫(kù)蚊屬幼蟲(chóng)(淡色庫(kù)蚊和致倦庫(kù)蚊)的控制。Bs制劑主要有Bsc3—4l、Bs一2362、Bs一10等。Bs制劑較Bti制劑易產(chǎn)生抗性，但實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)Bs產(chǎn)生抗性的蚊幼蟲(chóng)對(duì)Bti卻仍然表現(xiàn)出高度敏感性。因此，可以利用這一點(diǎn)，聯(lián)合使用兩種制劑，產(chǎn)生協(xié)同作用，擴(kuò)大殺蚊譜，延長(zhǎng)藥物維持時(shí)間，提高殺滅療效，并預(yù)防或延緩蚊幼蟲(chóng)對(duì)Bs產(chǎn)生抗性。另外，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，也使用包含了Bs的二元蛋白 BsB和Bti的四個(gè)蛋白(Cry4A，Cry4B，CryllA和 CytlA)的重組菌株，或者包含了Bs一2362和Bti兩種菌株的殺蚊毒素的重組菌株用于蚊蟲(chóng)控制，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，可擴(kuò)大殺蚊譜，藥效延長(zhǎng)至7—2l天，控蚊效果大大提高。
殺蚊毒素蛋白
球形芽孢桿菌對(duì)不同蚊幼蟲(chóng)的毒殺作用主要是由其產(chǎn)生的毒素蛋白實(shí)現(xiàn)的。現(xiàn)已證明在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中能產(chǎn)生兩類(lèi)不同毒素蛋白，一類(lèi)是存在于所有高毒力菌株中的晶體毒素蛋白；另一類(lèi)是存在于低毒力菌株中部分高毒力菌株中的Mtx毒素蛋白。
晶體毒素
所有高毒力和部分中毒力菌株（如LP1-G）在其芽孢形成過(guò)程中能形成位于芽孢孢外膜內(nèi)的伴孢晶體。該晶體是有等量的51.4和41.9kD多肽（記為P51和P42）組成。P51和P42合成于細(xì)菌芽孢形成期，并在芽孢形成Ⅲ期通過(guò)兩蛋白的相互作用和折疊而組裝形成晶體[4,15]。P51和P42的同時(shí)存在是形成伴孢晶體所必需的。在B. subtilis、Bs和Bti重組子中單獨(dú)表達(dá)形成的P51和P42只能以無(wú)定形包含物形式存在；只有兩種蛋白同時(shí)表達(dá)，才能形成典型的伴孢晶體；但兩種蛋白在B. subtilis重組子中同時(shí)表達(dá)只能形成無(wú)晶體結(jié)構(gòu)的卵圓形和圓形的包含物，而只有缺失兩結(jié)構(gòu)基因間的核酸序列的融合基因才能表達(dá)形成晶體。這說(shuō)明在Bs和Bti中含有促使蛋白穩(wěn)定和晶體化的因子[17～18]。
Western Blot表明P51和P42蛋白間無(wú)交叉反應(yīng)，說(shuō)明它們之間無(wú)較強(qiáng)的同源性。但P51和P42在25%（90個(gè)氨基酸）位置上的氨基酸是完全相同的，其中，有4個(gè)區(qū)域的氨基酸性序列有高度的保守性，這些保守區(qū)域在兩蛋白中的功能各不相同，可能同毒素蛋白的殺蚊活性相關(guān)。
Mtx毒素
目前在SSII-1、Kellen Q和2173等低毒力菌株及部分高毒力菌株中發(fā)現(xiàn)Mtx毒素[6,27～30]。這些毒素的合成同芽孢的形成不相關(guān)，它合成于細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)體生長(zhǎng)階段。mtx的啟動(dòng)子同LacZ的融合實(shí)驗(yàn)也表明該毒素營(yíng)養(yǎng)體時(shí)期表達(dá)。同晶體毒素相比，Mtx毒素相對(duì)不穩(wěn)定，熱處理、反復(fù)的凍熔都會(huì)嚴(yán)重影響其殺蚊活性。脫氧核糖核酸雜交實(shí)驗(yàn)證明所有的Mtx毒素同晶體毒素?zé)o同源性。
Mtx1毒素：Mtx1毒素是一種100kD的可溶性毒素（記為P100），由870個(gè)氨基酸組成。它的N-末端有一個(gè)具有G+細(xì)菌信號(hào)肽特征的序列，與ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶催化亞基同源；C-末端有三個(gè)約90個(gè)氨基酸末端重復(fù)序列。這種P100可以通過(guò)去掉N-末端信號(hào)肽形成97 kD蛋白，也可被蚊幼蟲(chóng)中腸蛋白酶降解形成27和70kD的蛋白多肽，其中27kD含有一個(gè)同轉(zhuǎn)膜序列相對(duì)應(yīng)的區(qū)域，而且同幾種ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶毒素有弱的同源性。而且缺失實(shí)驗(yàn)也證明，27kD片段能自身ADP-核糖基化，70kD片段能使蚊細(xì)胞發(fā)生病理反應(yīng)，只有兩種蛋白片段的同時(shí)存在，才對(duì)蚊幼蟲(chóng)表現(xiàn)出毒性[32,33]。純化的Mtx毒素同晶體毒素的殺蚊活性相當(dāng)（LC50值15 ng/mL)，但由于這種毒素合成于營(yíng)養(yǎng)體生長(zhǎng)階段，不能形成晶體，易被細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的蛋白酶降解形成無(wú)活性的多肽成分。
Mtx2毒素、Mtx3毒素：Mtx2毒素和Mtx3毒素都是從SSII-1菌株中分離出的由292和326個(gè)氨基酸組成，分子量分別為31.8和35.8kD的毒素蛋白，它們同P100毒素和晶體毒素?zé)o同源性，而同產(chǎn)氣夾膜羧菌梭菌屬 perfrigens的33kD的ε-毒素及綠濃桿菌Pseudomonas aeruginos的31.68kD細(xì)胞毒素有同源性[27,29]。Mtx2和Mtx3間有38%的同源性，都含有一個(gè)G+細(xì)菌的信號(hào)肽和假定的轉(zhuǎn)膜區(qū)。對(duì)從6個(gè)不同Bs有毒菌株中分離的Mtx2比較分析，其氨基酸序列只有幾個(gè)氨基酸差異，對(duì)蚊幼蟲(chóng)的毒性和殺蚊譜也有差異，其中224位置的氨基酸決定了該毒素殺蚊活性和殺蚊譜。
作用方式
Charles利用電鏡詳細(xì)研究了蚊幼蟲(chóng)取食孢晶混合物后中腸上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，在敏感的尖音庫(kù)蚊中，首先在胃盲囊和中腸后部出現(xiàn)電子密度低的區(qū)域，細(xì)胞形成空泡，線(xiàn)粒體膨大，但并未發(fā)現(xiàn)中腸細(xì)胞的裂解[36,37]。
蚊幼蟲(chóng)取食孢晶混合物后，晶體在中腸堿性環(huán)境和蛋白酶的作用下迅速溶解，釋放出51.4和41.9kD毒素蛋白，然后進(jìn)一步降解形成43和39kD的活性蛋白多肽[38,39]。在敏感和非敏感蚊幼蟲(chóng)體內(nèi)，晶體蛋白都能被溶解和激活，因此晶體蛋白對(duì)不同蚊幼蟲(chóng)的毒性差異并不是由于晶體蛋白的溶解和激活方面的差異造成的[6,39]。
用熒光素標(biāo)記的不同毒素蛋白成分研究了晶體毒素在蚊幼中腸上皮細(xì)胞的結(jié)合部位[18,40]。P51不能結(jié)合到伊蚊中腸上，P42只對(duì)整個(gè)中腸進(jìn)行較弱的結(jié)合；對(duì)于致倦庫(kù)蚊幼蟲(chóng)，只有P51能結(jié)合到中腸部位，而P42只對(duì)整個(gè)中腸進(jìn)行非特異性的結(jié)合，只有在P51存在的情況下，P42才能特異性結(jié)合到胃盲囊和中腸后部。同時(shí)缺失實(shí)驗(yàn)而表明P51的N-末端和C-末端及P42的C-末端氨基酸對(duì)二元毒素同中腸的特異性結(jié)合起著重要的作用[18,41]。根據(jù)這些體內(nèi)和體外的特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提出這樣一種假設(shè)，即P51的N-末端區(qū)域同蚊幼蟲(chóng)中腸上皮細(xì)胞特定區(qū)域結(jié)合，其C-末端同P42的N-末端區(qū)域相互作用，使P42也結(jié)合到相同的部位而發(fā)生毒殺作用。目前還不清楚二元毒素結(jié)合到中腸上皮細(xì)胞后的詳細(xì)作用機(jī)理。有人認(rèn)為二元毒素通過(guò)內(nèi)攝作用而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮毒性[40,41]，或停留在膜上由P42在細(xì)胞膜上形成微孔導(dǎo)致胞內(nèi)水分外流。用125I-標(biāo)記的活化毒素蛋白同敏感和非敏感中腸上皮細(xì)胞膜分離物（BBMF）的特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明了敏感蚊幼蟲(chóng)中腸中晶體毒素蛋白特異性結(jié)合位點(diǎn)的存在[6,41,42]。證明二元毒素蛋白同敏感蚊幼蟲(chóng)的BBMF中的單一類(lèi)結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，但未發(fā)現(xiàn)晶體毒素同伊蚊BBMF的特異性結(jié)合，這同熒光標(biāo)記毒素的研究結(jié)果相同。晶體毒素的兩組分都能結(jié)合到敏感蚊幼蟲(chóng)的BBMF上，但Scatchard線(xiàn)性分析卻證明只有一種組分能結(jié)合到位點(diǎn)上，這同上面提出的二元毒素作用機(jī)理假設(shè)相符合。結(jié)合單獨(dú)P42和P51對(duì)BBMF的特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果和其對(duì)蚊幼蟲(chóng)的生物測(cè)定結(jié)果，一般認(rèn)為在晶體毒素中，P42決定毒素的殺蚊活性和特異性，P51同蚊幼蟲(chóng)中腸敏感位點(diǎn)的特異性結(jié)合，只有兩種蛋白組分的協(xié)同作用才會(huì)表現(xiàn)出毒性，晶體毒素是一種二元毒素。
目前，人們?cè)噲D分離出蚊幼中腸上皮的結(jié)合位點(diǎn)，但一直未成功，有關(guān)結(jié)合位點(diǎn)的特性不詳，只證明糖類(lèi)物質(zhì)并不能抑制二元毒素同其結(jié)合。
對(duì)幾類(lèi)Mtx毒素的作用機(jī)理并未進(jìn)行詳細(xì)研究，只對(duì)P100作用機(jī)理進(jìn)行了一些初步研究。敏感蚊幼蟲(chóng)取食P100蛋白和二元毒素蛋白后的病理變化相差很大，說(shuō)明兩者存在著完全不同的作用機(jī)理。如前所述，P100毒素同Bt的δ-內(nèi)毒素和其它殺蟲(chóng)脒毒素都無(wú)同源性，其N(xiāo)-末端存在的假定的轉(zhuǎn)膜區(qū)對(duì)其毒性的實(shí)現(xiàn)是必需的，而去掉信號(hào)肽序列的97kD多肽同樣對(duì)蚊幼蟲(chóng)有毒，說(shuō)明信號(hào)肽是非必需的[30,32]。
由于P100毒素同百日咳，白喉和霍亂毒素有相同的氨基酸基元(Motif)。而這些毒素都是通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)的ADP-核糖基化而發(fā)生作用。因此，P100蛋白也可能同ADP-核糖基化有關(guān)。在胰蛋酶和蚊幼蟲(chóng)中腸蛋白酶的作用下，P100蛋白可以降解為27kD的N末端和70kD的C-末端兩個(gè)片段。27kD能使庫(kù)蚊幼蟲(chóng)細(xì)胞抽提液中的38和42kD蛋白核糖基化；而70kD和97kD（P100缺失N-末端非必需的信號(hào)序列）的片段可導(dǎo)致蚊幼蟲(chóng)細(xì)胞系發(fā)生明顯的病理學(xué)變化，但70kD片段缺少ADP-核糖基酶活性。因此，P100蛋白有兩個(gè)功能區(qū)：C-末端可導(dǎo)致蚊幼蟲(chóng)細(xì)胞發(fā)生病理學(xué)變化，N-末端具有ADP-核糖基化活性。
Mtx2和Mtx3同產(chǎn)氣甲膜桿菌的毒素和綠濃桿菌細(xì)胞毒素有同源性，因此認(rèn)為這兩種Mtx毒素可能同細(xì)胞上的微孔形成有關(guān)。
參考資料 >