蛋白質測序是一種通過對蛋白質的氨基酸序列及其高級結構進行實驗測定的技術。盡管可以根據中心法則從核酸序列推導蛋白質序列，但蛋白質測序能夠更精確地追蹤轉錄后修飾（PTM）。對于已知物種的蛋白質，僅需確定部分序列，便可通過與蛋白質序列數據庫對比，推測出對應蛋白。最早的人類蛋白質測序工作始于1953年，當時桑格成功測序了牛胰島素?，F今，最常見的蛋白質測序方法是蛋白質譜法，其中蛋白質首先被分解為肽段，隨后通過質譜儀獲取其電荷與分子質量比例，從而推斷氨基酸序列。此外，埃德曼降解法仍然廣泛應用于蛋白質N端的測序。
歷史沿革
蛋白質測序的歷史始于1953年，當時弗雷德里克·桑格首次完成了對牛胰島素的測序，這是人類歷史上的首次蛋白質測序。此后，桑格所發展的測序方法以其名字命名為桑格法，成為早期蛋白質測序的重要手段。
方法原理
蛋白質測序的主要目標是對蛋白質的一級結構進行測定，即確定構成蛋白質的多肽鏈數量及其氨基酸序列。這一過程是蛋白質化學研究的基礎。自桑格的工作以來，已經了解了大約十萬種不同蛋白質的一級結構。
實驗條件
蛋白質測序的成功實施有賴于一些基本條件的滿足，包括樣品的高純度（超過97%）、已知的蛋白質分子量、明確的亞基組成、測定氨基酸組成以及計算每種氨基酸的數量。此外，還需要測定水解液中的氨量，以便計算酰胺的含量。
測序流程
蛋白質測序的過程通常涉及一系列步驟，包括肽鏈的拆分和分離、多肽鏈數目的測定、二硫鍵的斷裂、每條多肽鏈氨基酸組成的測定、N端和C端的測定、多肽鏈的斷裂、每個肽段氨基酸順序的測定以及肽段在多肽鏈中的次序確定。最終，還需確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。
酸水解
酸水解常采用6mol/L的鹽酸或4mol/L的硫酸，在105-110℃的溫度下進行，反應時間為約20小時。這種方法不易導致水解產物的消旋化，但會破壞色氨酸，并且含羥基的氨基酸如絲氨酸或Thr可能會部分分解，而門冬酰胺和谷氨酰胺側鏈的酰胺基會被水解成羧基。
堿水解
堿水解一般使用5mol/L的氫氧化鈉，在煮沸狀態下持續10-20小時。這種方法會導致許多氨基酸遭到一定程度的破壞，產率較低，而且部分水解產物會發生消旋化。然而，堿水解的優勢在于色氨酸在水解過程中不受影響。
酶水解
酶水解是另一種常見的蛋白質肽鏈斷裂方法，目前已發現十余種蛋白水解酶。這種水解方法不會破壞氨基酸，也不易引發消旋化，產生的產物主要是較小的肽段。
應用
蛋白質測序在生物學領域具有重要價值，不僅有助于理解蛋白質的功能，還能幫助識別新的蛋白質種類。
參考資料 >
川大科研團隊破譯蛋白質測序難題.人民網.2024-08-22
小小納米孔破解蛋白質測序難題.河北省科學技術廳.2024-08-22
蛋白測序的原理、步驟、以及N端測序服務的注意事項.食品伙伴網.2024-08-22