蔗糖酶又稱(chēng)“轉(zhuǎn)化酶”。糖酶之一，蔗糖酶（invertase）（β-D-呋喃果糖苷水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（ec3.2.1.26）特異地催化非還原糖中的β-D-喃果糖苷鍵水解，具有相對(duì)專(zhuān)一性。不僅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。
基本介紹
蔗糖酶。糖苷酶之一。催化蔗糖水解成為果糖和葡萄糖的一種酶，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，主要從酵母中得到。
自1860 年Bertholet 從釀酒酵母 Sacchacomyces Cerevisiae 中發(fā)現(xiàn)了蔗糖酶以來(lái), 它已被廣泛地進(jìn)行了研究。蔗糖酶（β -D-呋喃果糖苷果糖水解酶，fructofuranoside fructohydrolase， invertase）（EC 3.2.1.26）特異地催化非還原糖中的α-呋喃果糖苷鍵水解, 具有相對(duì)專(zhuān)一性。不僅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖,也能催化棉子糖水解, 生成密二糖和果糖。
該酶以兩種形式存在于酵母細(xì)胞膜的外側(cè)和內(nèi)側(cè),在細(xì)胞膜外細(xì)胞壁中的稱(chēng)之為外蔗糖酶(external yeast invertase)，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% ~70(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 糖成分的糖蛋白；在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)細(xì)胞質(zhì)中的稱(chēng)之為內(nèi)蔗糖酶（internal yeast invertase），含有少量的糖。兩種酶的蛋白質(zhì)部分均為雙亞基（二聚體）結(jié)構(gòu)，2種形式的酶的氨基酸組成不同，外酶每個(gè)亞基比內(nèi)酶多2種氨基酸——絲氨酸和甲硫氨酸，它們的分子質(zhì)量也不同，外酶約為270KD（或220KD,與酵母的來(lái)源有關(guān)），內(nèi)酶約為135KD。盡管這兩種酶在組成上有較大的差別，但其底物專(zhuān)一性和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)仍十分相似，但由于內(nèi)酶含量很少，極難提取。
作用
蔗糖在蔗糖酶的催化下．水解為D-葡萄糖和D-果糖兩種還原糖。蔗糖酶在植物的運(yùn)輸貯藏、糖類(lèi)代謝中發(fā)揮主要作用．并在滲透調(diào)節(jié)、抗逆性生長(zhǎng)繁殖、以及信號(hào)傳導(dǎo)方面也發(fā)揮著重要的作用。
植物中蔗糖酶的分類(lèi)
根據(jù)植物中蔗糖酶所處亞細(xì)胞位置，蔗糖酶可分為液胞型蔗糖酶、細(xì)胞質(zhì)型蔗糖酶和細(xì)胞壁型蔗糖酶。前兩者又統(tǒng)稱(chēng)為胞內(nèi)蔗糖酶，細(xì)胞壁型蔗糖酶又被稱(chēng)為胞外蔗糖酶。不同的蔗糖酶進(jìn)行反應(yīng)所需的最適pH值也有所不同，由此蔗糖酶又可分為酸性蔗糖酶和中性/堿性蔗糖酶。液胞型蔗糖酶和細(xì)胞壁型蔗糖酶在pH4.5至5.0時(shí)催化效率最高，因此也稱(chēng)為酸性蔗糖酶。細(xì)胞質(zhì)型蔗糖酶水解蔗糖的最適pH值為中性或略微偏堿性，因此稱(chēng)為中性/堿性蔗糖酶。而根據(jù)其溶解性，蔗糖酶又可分為可溶性蔗糖酶（包括液胞型蔗糖酶和細(xì)胞質(zhì)型蔗糖酶）與非溶性蔗糖酶（細(xì)胞壁型蔗糖酶）。
提取方法
酵母提純
酵母離心(8 000 r/min)15 min后收集菌體。將收集到的菌體用蒸餾水洗滌，離心，再洗滌，重復(fù)數(shù)次，直到菌體呈白色，傾出上清液，將不含雜質(zhì)的干凈的酵母保存待用。
粗酶液的制備
準(zhǔn)確稱(chēng)取離心分離后的酵母10g，加入60mL0．5mmol/L的SDS溶液溶解，在pH值為5．5、50℃水浴中加熱12h后取出，4℃、10 000 r/min離心20 min．上清液即為粗制酶液。4℃保存。
葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定
以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)。以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定
以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)。以吸光度為縱坐標(biāo)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線．
蔗糖酶活性的測(cè)定
稀釋酶液0．5 mL．加入0．3 mL pH值為4．6、0．1 mol/L的NaAc—HAc緩沖液．0．2 mL 0．1 mol/L的蔗糖溶液．37℃準(zhǔn)確反應(yīng)15rain后．加0．125 mL l mol/L的氫氧化鈉溶液中止反應(yīng)。用DNS法測(cè)還原糖法在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定形成的還原糖量。在該條件下。蔗糖酶液1 min轉(zhuǎn)化底物蔗糖生成1g葡萄糖定義為1個(gè)活力單位。
粗酶的乙醇初步分離
在所提粗制酶液中加入乙醇使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)30%，4℃放置過(guò)夜，4℃、10 000 r/min離心15 min．取上清液．追加乙醇使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)50%，4℃放置1 h，4℃、11 000 r/min離心15 min．棄上清液．沉淀用雙蒸水溶解．4℃保存。經(jīng)SDS抽提法提取．質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%的乙醇沉淀所得的酶液用透析法(pH值為7.0的0.05 mol/L%s—HCI緩沖液)充分透析。所得透析液4℃保存。
SDS抽提法提取釀酒酵母中蔗糖酶
工藝條件優(yōu)化：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上。選取SDS摩爾濃度、pH值、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)條件，考察其對(duì)酵母蔗糖酶抽提效果的影響．采用4因素3水平正交表L93。做正交試驗(yàn)。
蔗糖酶的純化
采用O一瓊脂糖凝膠FF陰離子交換柱層析純化粗酶液。將SDS抽提法提取出的蔗糖酶活性高的粗制酶液經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%的乙醇沉淀，溶解透析后，過(guò)Q-瓊脂糖凝膠FF陰離子樹(shù)脂床(用pH值為7．0、0．05 mol/L 三羥甲基氨基甲烷HCl緩沖液充分平衡)。用0～1 mol/L、60 min線性梯度的NaCI溶液(內(nèi)含pH值為7．0、0．05 mol/L%s-HCI緩沖液)洗脫。體積流量為0．5 mL/min，每管收集mL。測(cè)定各管洗脫液的蔗糖酶活性與蛋白質(zhì)含量，合并蔗糖酶活力高的若干管流出液。流出液經(jīng)過(guò)透析脫鹽,真空干燥后即為純化的酵母蔗糖酶。
參考資料 >
萬(wàn)方數(shù)據(jù)知識(shí)服務(wù)平臺(tái).萬(wàn)方數(shù)據(jù).2021-11-07