全文
ELISA（酶聯免疫吸附試驗，酶聯免疫試劑盒）是一種廣泛應用于多種疾病診斷的免疫測定技術。該技術利用酶的催化作用和抗原抗體的特異性結合，實現了快速、敏感、簡便的檢測。
種類
ELISA試劑盒的種類豐富多樣，涵蓋了自身免疫檢測試劑盒、細胞因子ELISA試劑盒、流式細胞儀用試劑類、天然橡膠手工及上機試劑、內分泌檢測試劑盒、腫瘤標記物檢測試劑、微生物傳染病檢測試劑等多種類別。此外，還包括實驗室儀器類、PCR及相關試劑、肝纖維化檢測、單克隆抗體、ELISPOT、特種蛋白、微色譜柱、優生優育TORCH、生化試劑、抗體、細胞株以及其他分子生物學研究用試劑。
使用
ELISA試劑盒的使用涉及樣本的采集和處理。標本必須為液體，不含沉淀，包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細胞培養上清、組織勻漿等。每個標本量收集體積=100ul×檢測種類。樣品采集前應了解待檢測成份的穩定性。對于需要周期收集的標本，應將其及時分裝并在-20℃或-70℃條件下保存，避免反復凍融。標本2-8℃可保存48小時，-20℃可保存1個月，-70度可保存6個月。部分激素類標本需添加抑肽酶。
試劑盒
試劑的性質
基本原理
ELISA方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價結合，此類結合不影響酶的生物學活性，也不會改變抗體的免疫學特性。酶標記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發生特異性結合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下發生顏色變化，顏色的深淺與標本中相應抗體或抗原的量成正比。因此，可通過底物的顏色反應來判斷是否存在相應的免疫反應。
用于標記的酶
ELISA中常用的酶包括辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。其中，HRP因其高度的活性和敏感性而最為常見。HRP的底物種類多樣，常用的是1，2-苯二胺（OPD），其產物為橙色，可溶性高，敏感性高，最大吸收值在490nm。酶的活性以在pH10反應系統中，37℃1分鐘水解1μg磷酸苯二鈉為一個單位。
抗體的酶標記方法及標記效果測定
標記方法
良好的酶結合物取決于兩個條件：即高效價的抗體和高活性的酶。抗體的活性和純度對制備標記抗體至關重要，因為特異性免疫反應隨抗體活性和純度的增加而增強。在酶標記過程中，抗體的活性有所降低，故需要純度高、效價高及抗原親和力強的抗體球蛋白，最好使用親和層析提純的抗體，可提高敏感性，而且可稀釋使用，減少非特異性吸附。
酶標抗體標記效果測定
測定內容包括酶和抗體活性、結合物中酶含量和IgG含量、酶與IgG摩爾比值以及結合率。酶與抗體的活性常用瓊脂擴散或免疫電泳法測定，使抗原與抗體形成沉淀線，經pbs漂洗1天，再以蒸餾水浸泡1小時，將瓊脂凝膠片浸于酶底物溶液中著色，如果出現應有的顏色反應，再用生理鹽水浸泡，顏色仍然不褪，表示結合物既有酶的活性，也有抗體活性。良好的結合物在顯色后，瓊擴滴度應在1:16以上。另一個測定方法是用系列稀釋的酶標抗體直接以ELISA方法進行方陣滴定，此法不僅可以測定標記效果，還可以確定酶標抗體的使用濃度。
試劑盒的類型
根據ELISA所用的固相載體的不同，試劑盒可分為三大類型：聚苯乙烯微量板為載體的ELISA（微量板ELISA）、硝酸纖維膜為載體的斑點ELISA（Dot-ELISA）以及采用疏水性聚脂布作為載體的布ELISA（C－ELISA）。在微量板ELISA中，又根據其性質不同分為間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、雙夾心ELISA、競爭ELISA、阻斷ELISA及抗體捕捉ELISA。
吸附試驗
間接ELISA
本法主要用于檢測抗體。以鴨病毒性肝炎（DVH）抗體的ELISA為例，間接ELISA的操作程序如下：
1. 加抗原包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干
2. 加待檢血清 → 37℃ 2小時，洗滌三次、拋干
3. 加酶標抗體 → 37℃ 2小時，洗滌三次、拋干
4. 加底物液 → 37℃ 30分鐘，加終止液
5. 用ELISA檢測儀測定OD值，并計算出P/N比值。
雙抗體夾心ELISA
本法主要用于檢測大分子抗原。現以檢測雞雞傳染性囊病病毒（IBDV）的雙夾心抗體ELISA為例介紹本法的操作程序：
1. 加抗體（Ab-1）包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干
2. 加待檢抗原（Ag） → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
3. 加酶標抗體（ab3）→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
4. 加底物液 → 37℃ 15分鐘，加終止液
5. 用ELISA檢測儀測定OD值。
雙夾心ELISA
此法與雙抗體夾心ELISA的主要區別在于：它是采用酶標抗抗體檢查多種大分子抗原，它不僅不必標記每一種抗體，還可提高試驗的敏感性。此法的基本程序為：
1. 加抗體（Ab-1）包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干
2. 加待檢抗原（Ag） → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
3. 加用非同種動物生產的特異性抗體（Ab-2）→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
4. 加入酶標抗ab2抗體（AB-3）→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
5. 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液
6. 用ELISA檢測儀測定OD值。
競爭ELISA
此法主要用于測定小分子抗原及半抗原，其原理類似于放射免疫測定。其基本程序為：
1. 抗體包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干
2. 加入待檢抗原及一定量的酶標抗原（對照孔僅加酶標抗原）→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
3. 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液
4. 用ELISA檢測儀測定OD值。
阻斷ELISA
本法主要用于檢測型特異性抗體。該方法現已成為豬傳染性胃腸炎（TGE）、豬偽狂犬病（PR）及豬胸膜肺炎（AP）的主要檢測方法。下面以AP2型抗體的阻斷ELISA檢測法為例介紹其操作程序：
1. 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干
2. 用200μl阻斷緩沖液進行封閉 → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
3. 加工作量1:4稀釋被檢豬血清100μl → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
4. 加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干
5. 加100μl工作量豬抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
6. 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液
7. 用ELISA檢測儀測定OD值。
抗體捕捉ELISA
本法主要用于檢測IgM抗體。由于IgM抗體出現于感染早期，所以檢測出IgM，則可作為某種疾病的早期診斷。抗體捕捉ELISA根據所用標記方式不同可分為標記抗原、標記抗體、標記抗抗體捕捉ELISA等幾種，其中以標記抗原捕捉ELISA比較有代表性，該方法的主要程序為：
1. 用抗u鏈（抗IgM重鏈）抗體包被→37℃ 60分鐘后置4℃過夜，洗滌三次、拋干
2. 加待檢血清 → 37℃ 2小時，洗滌三次、拋干
3. 加酶標抗原 → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
4. 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液
5. 用ELISA檢測儀測定OD值。
斑點ELISA
與常規的微量板ELISA比較，Dot-ELISA具有簡便、節省抗原等優點，而且結果可長期保存；但其也有不足，主要是在結果判定上比較主觀，特異性不夠高等。該方法的主要操作程序為：
1. 載體膜的預處理及抗原包被 取硝化纖維素膜用蒸餾水浸泡后，稍加干燥進行壓圈。將陰性、陽性抗原及被檢測抗原適度稀釋后加入圈中，置37℃使硝酸纖維素膜徹底干燥。每張7cm×2.3cm的膜一般可點加40－53個樣品，每個壓圈可加抗原液1－20μl。
2. 封閉 將硝酸纖維素膜置于封閉液中，37℃感作15－30分鐘。封閉液多采用含有正常動物血清、pH7.2或pH7.4的pbs。
3. 加被檢血清 可直接在抗原圈上加，也可剪下抗原圈、置于微量板孔中，再加入一定量適度稀釋的待檢血清，37℃反應一定時間，用洗滌液洗三次，每次1－3分鐘。洗滌液一般為一定濃度的PBS-Tween溶液。
4. 加酶標抗體，37℃反應一定時間后，用洗滌液洗三次。
5. 顯色加入新鮮配制的底物液，37℃反應一定時間后，去掉底物液，加蒸餾水洗滌終止反應。
6. 結果判定 以陽性、陰險血清作為對照，膜片中央出現深棕紅色斑點者為陽性反應，否則為陰性反應。
布ELISA
C－ELISA（Cloth-ELISA）是加拿大學者Blais, B. W.等于1989年建立的一種新型免疫檢測技術。該方法是以疏水性聚脂布（Hydrophobic Polyester Cloth）即滌綸布為固相載體，這種大孔徑的的疏水布具有吸附樣品量大，可為免疫反應提供較大的表面積，提高反應的敏感性，且容易洗滌，不需特殊儀器等優點。其基本原理與Dot-ELISA類似，只是載體不同。以對布氏桿菌抗原的檢測為例，C－ELISA的主要程序為：
1. 首先把抗布氏桿菌的血清包被（吸附）在聚脂布上，并經洗滌及封閉；
2. 加被檢樣品并于室溫下感作30分鐘，然后洗5次；
3. 加酶標記的抗布氏桿菌抗體，于室溫下感作30分鐘，然后洗滌5次；
4. 加入底物液顯色；
5. 利用酶標儀測定OD值。
標本的采取和保存
可用作ELISA測定的標本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標本可直接進行測定（如血清、尿液），有些則需經預處理（如糞便和某些分泌物）。大部分ELISA檢測均以血清作為檢測標本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。制備血漿標本需借助于抗凝劑，而血清標本只需待血清自然凝固、血塊收縮后即可取得。除特殊情況外，在醫學檢驗中均以血清作為檢測標本。在ELISA中血漿和血清可同等應用。血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP，也會產生假陽性反應。如在冰箱中保存過久，其中的可發生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。一般說來，在5天內測定的血清標本可放置于4℃，超過一周測定的需低溫冰存。凍結血清融解后，蛋白質局部濃縮，分布不均，應充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強烈振蕩?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢吮緫入x心或過濾，澄清后再檢測。反復凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應注意無菌操作，也可加入適當防腐劑。
試劑的準備
按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應為新鮮的和高質量的。自配的緩沖液應用pH計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。
加樣
在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結合物，加底物。加樣時應將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產生氣泡。
保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結合物后?？乖贵w反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育，在ELISA中似不恰當。
溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。在建立ELISA方法作反應動力學研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37℃經1-2小時，產物的生成可達頂峰。為加速反應，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應4℃更為徹底，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過夜，以形成最多的沉淀。但因所需時間太長，在ELISA中一般不予采用。
保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴，可將ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底應貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA板應放在濕盒內，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應如此。無論是水浴還是濕盒溫育，反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應，操作時的室溫應嚴格限制在規定的范圍內，標準室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時可根據說明書的要求控制溫育。室溫溫育時，ELISA板只要平置于操作臺上即可。應注意溫育的溫度和時間應按規定力求準確。為保證這一點，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。
洗滌
洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA?是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既是疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合，從而削弱蛋白質與固相載體的結合，并借助于親水基團和水分子的結合作用，使蛋白質回復到水溶液狀態，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。
洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種，過程如下：
（1）浸泡式 a.吸干或甩干孔內反應液；b.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即甩去）；c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1-2分鐘，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短；d.吸干孔內液體。吸干應徹底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干；e.重復操作c和d，洗滌3-4次（或按說明規定）。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數或延長浸泡時間。
（2）流水沖洗式 流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水。洗滌時附接一特殊裝置，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動淋洗，持續沖洗2分鐘后，吸干液體，再用蒸餾水浸泡2分鐘，吸干即可。浸泡式猶如盆浴，流水沖洗式則好比淋浴，其洗滌效果更為徹底，且也簡便、快速。已有實驗表明，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌。洗滌時設法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。
參考資料 >
單克隆抗體發展歷程.好看視頻.2024-11-15
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