雙脫氧鏈終止法主要用于脫氧核糖核酸基因分析，是現在應用最多的核酸測序技術（也即第一代DNA測序技術），由Sanger等1977年發明提出。
原理
核酸模板在核酸聚合酶、引物、四種單脫氧堿基存在條件下復制或轉錄時，如果在四管反應系統中分別按比例引入四種雙脫氧堿基，只要雙脫氧堿基摻入鏈端，該鏈就停止延長，鏈端摻入單脫氧堿基的片段可繼續延長。如此每管反應體系中便合成以共同引物為5’端，以雙脫氧堿基為3’端的一系列長度不等的核酸片段。反應終止后，分四個泳道進行電泳。以分離長短不一的核酸片段（長度相鄰者僅差一個堿基），根據片段3’端的雙脫氧堿基，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。
測序程序
（一） Sanger雙脫氧鏈終止法（酶法）測序程序 操作程序是按脫氧核糖核酸復制和核糖核酸反轉錄的原理設計的。
1.分離待測核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是雙鏈，也可以是單鏈。
2.在4只試管中加入適當的引物、模板、4種dNTP（包括放射性標記的 ddNTP，例如 P ddNTP和DNA聚合酶（如以RNA為模板，則用反轉錄酶），再在上述4只管中分別加入一種一定濃度的ddNTP（雙脫氧核酸）。
3.與單鏈模板（如以雙鏈作模板，要作變性處理）結合的引物，在脫氧核糖核酸聚合酶作用下從5’端向3’端進行延伸反應，32P隨著引物延長摻入到新合成鏈中。當ddNTP摻入時，由于它在3’位置沒有羥基，故不與下一個dNTP結合，從而使鏈延伸終止。ddNTP在不同位置摻入，因而產生一系列不同長度的新的DNA鏈。
4.用變性聚丙烯胺凝膠電泳同時分離4只反應管中的反應產物，由于每一反應管中只加一種ddNTP（如ddATP），則該管中各種長度的DNA都終止于該種堿基（如A）處。所以凝膠電泳中該泳道不同帶的脫氧核糖核酸 3’ 末端都為同一種雙脫氧堿基。
5.放射自顯影。根據四泳道的編號和每個泳道中DNA帶的位置直接從自顯影圖譜上讀出與模板鏈互補的新鏈序列。
操作步驟
（以雙鏈DNA測序為例）。
變性雙鏈模板的制備
（1）材料 三羥甲基氨基甲烷/葡萄糖緩沖液（20mmol/L Tris-HCl pH8.0，10mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉，50mmol/L 葡萄糖），1% SDS，0.2mo1/L 氫氧化鈉，2-丙醇，TE緩沖液pH8.0，4mol/L LiCl，冰冷 70%和乙醇，2mol/L NaOH，2mmol/L EDTA。
（2）配制方法
① 取1.5ml處于對數生產期的培養菌液（含有待測病毒核酸的重組質粒模板），離心除去上清液后，用150ml 三羥甲基氨基甲烷/葡萄糖緩沖液 重懸菌團，在室溫下放置5分鐘。
② 加入300ml的1%SDS，0.2mol/L NaOH，顛倒混合約15次，在室溫下放置15分鐘，加入225ml 3mol/L乙酸鈉（pH4.5），顛倒約15次混合，在冰浴中放置45分鐘，然后離心5分鐘。
③ 將650ml上清液轉移至一支新管中，加入650ml2-丙醇，混合后在室溫下放置10分鐘，離心5分鐘后棄去異丙醇，抽真空干燥沉淀。
④ 用125ml TE(pH 8.0）重新溶解脫氧核糖核酸，加入375ml的4mol/L LiCl，在冰浴中放置20分鐘后，于4℃下離心5分鐘。
⑤ 將上清液轉移至一支新管中用飽和苯酚抽提后再用三氯甲烷抽提，加入2倍體積的異丙醇，在室溫下沉淀30分鐘，離心5分鐘，棄去上清液。
⑥ 用冰冷的70%乙醇洗沉淀，離心5分鐘，棄去上清液并干燥，用50ml TE緩沖液重新溶解沉淀。用紫外分光光度計測定質粒DNA含量。
⑦ 取0.2mg質粒DNA，并將體積調至9ml，加入1ml 2mol/L 氫氧化鈉，2mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉，在室溫下放置5分鐘，加入2ml 30mol/L乙酸鈉（pH 4.5）和8ml水。
⑧ 加入6ml冰冷無水乙醇，混合后在干冰/乙醇浴中放置15分鐘，在4℃下離心5分鐘，小心地棄去上清液，用冰冷的70%乙醇洗沉淀，離心5分鐘并小心地棄去上清液，真空抽干沉淀，并用TE緩沖液重新溶解沉淀。
延伸和終止反應
以利用T7脫氧核糖核酸聚合酶進行的雙脫氧鏈終止反應為例。
（1）材料 變性的雙鏈DNA模板（溶解在TE緩沖液中），0.5pmol/mL寡聚核苷酸引物（溶解在TE中，-20℃貯存），5×測序緩沖液（200mmol/L 三羥甲基氨基甲烷 pH7.5，50mmol/L 氯化鎂，-20℃貯存），0.1mol/l 二硫蘇糖醇（當月新配-20℃貯存），15pmol/L的3種dNTP混合物（缺dATP），1 000至1 500Ci/mmol32p dATP（在－20℃下達4至6周），修飾的T7 脫氧核糖核酸聚合酶，標準酶稀釋溶液（20mmol/L Tris－HCl pH7.5，0.5mg/mlBSA，10mmol/L- 2-巰基乙醇，4℃貯存），終止混合物（表2-30），甲酰胺上樣緩沖液（0.2ml 0.5摩爾/LEDTA pH8.0，10mg溴酚藍，10mg二甲苯藍，10ml甲酰胺）。
表2-30 T7DNA聚合酶終止反應混合物
反應成分 ddG ddA 滴滴涕 ddC 最終濃度
H2O 15 15 15 15 －
5×測序緩沖液 6 6 6 6 － 1mmol/L
4dNTP 6 6 6 6 200μmol/L
1mmol/L ddGTP 3 － － － 20μmol/L
1mmol/L ddATP － 3 － － 20μmol/L
1mmol/L ddTTP － － 3 － 20μmol/L
1mmol/L ddCTP － － － 3 20μmol/L
（2）配制方法
① 取4支0.5ml小離心管，標上G、A、T、C，每管加入7ml變性的雙鏈脫氧核糖核酸模板（分別為1和2mg），1ml寡聚核苷酸引物和2ml 5×測序緩沖液混合，65℃保溫2分鐘，在室溫下冷卻30分鐘。
② 每管加入1ml 0.1mol/L 二硫蘇糖醇，2ml 1.5mol/L 3種dNTP混合物，0.5ml32P dATP和2ml（2IU）修飾的T7DNA多聚酶混合物，在室溫下放置5分鐘。
③ 按標記每管分別加入3ml 4種ddNTP終止混合物的一種。
④ 短促離心后，在37℃下保溫5分鐘。
⑤ 加入5ml甲酰胺上樣緩沖液，上樣前在80℃下加熱2分鐘，并迅速置于冰浴上，每個樣品取3ml，上樣電泳。
測序反應物電泳和序列讀取
（2）按G、A、T、C次序加入每種樣品，在G、A和T各泳道上樣1ml，而在C泳道上樣1.5ml。
（3）上樣完畢加壓1700V電泳，根據樣品中溴酚藍和二甲苯藍染料遷移情況確定電泳時間。
（5）在60℃或80℃干燥30分鐘后，放射自顯影讀取序列。
讀取合成鏈的核苷酸序列時，應從下往上讀取。因為電泳時是從上向下的，即上為負極，下為正極，脫氧核糖核酸帶負電，從負極向正極移動。其中，小片段DNA移動速度最快，距離正極的點樣處最遠。所以，應該從最小片段讀起，即，從下向上讀取。
而模板鏈則應該從上向下讀取，并且轉換為測序的核苷酸的互補的核苷酸。
參考資料 >