2+和Mg2+可增加上述酶對(duì)PHFII-tau的去磷酸化作用。 ADP-tau的去磷酸化反應(yīng)條件除用較低的磷酸酶濃度外［8，9］，其余同PHFII-tau的去磷酸化條件。一、pp2A和PP-2B可在多部位使PHFII-tau去磷酸化
正文
探討阿爾茨海默病(AD)腦損傷逆轉(zhuǎn)的可能性及其途徑。方法 用去磷酸化和免疫印跡法研究AD腦損傷可逆性。結(jié)果 蛋白磷酸酶(PP)-2A和PP-2B可使AD神經(jīng)原纖維纏結(jié)中的II型雙螺旋絲（PHFII-tau）在Ser-199/Ser-202去磷酸化，Ser-396/Ser-404部分去磷酸化；此外，PP-2A和PP-2B可分別使PHFII-tau的Ser-46和Ser-235去磷酸化；去磷酸化后PHFII-tau的相對(duì)電泳遷移率加快。可增加上述酶對(duì)PHFII-tau的去磷酸化作用。酶的去磷酸化作用具有濃度依賴(lài)性，隨著酶濃度的增加，去磷酸化作用增強(qiáng)。結(jié)論 因?yàn)閠au蛋白異常過(guò)度磷酸化并形成PHF被認(rèn)為是AD神經(jīng)原纖維退化的基礎(chǔ)，PHF可在體外被蛋白磷酸酯酶去磷酸化的結(jié)果提示，AD腦損傷可能是可逆的。
阿爾茨海默(AD)腦中有三種tau蛋白：(1)易溶型非異常磷酸化的tau(C-tau)；(2)易溶型異常磷酸化的tau(ADp-tau)；(3)以雙螺旋絲聚集的tau(PHF-tau)。根據(jù)PHF-tau在月桂醇硫酸鈉(SDS)中的溶解性，又可將其分為PHFI-tau和PHFII-tau［1］。與ADp-tau和PHFI-tau不同，PHFII-tau還被部分泛素化修飾［2］。
根據(jù)Cohen［3］的分類(lèi)法，大量存在于人腦中的磷酸絲氨和磷酸蘇氨酰蛋白磷酸酯酶主要包括四種類(lèi)型:pp1，PP-2A，PP-2B和PP-2C。從過(guò)去的研究中發(fā)現(xiàn)，PP-2C不使所研究的ADp-tau任何位點(diǎn)發(fā)生去磷酸化作用，而PP-1僅對(duì)少數(shù)位點(diǎn)起反應(yīng)［4］。推測(cè)PP-2A和PP-2B可能在AD腦中tau異常磷酸化過(guò)程中起關(guān)鍵作用，所以二者均被選用于本研究。
對(duì)象和方法
一、組織和抗體來(lái)源
該研究中的AD及年齡、性別匹配對(duì)照者的腦組織來(lái)源于死后6小時(shí)內(nèi)的尸體解剖(各取6例混合后制備勻漿)，AD確診基于尸檢組織切片的病理學(xué)檢查，人腦組織均貯于直至使用。牛腦PP-2A和PP-2B的分離純化分別參照Cohen等［5］和Sharma等［6］的方法。多克隆抗體92e和102C由Iqbal小組制備。單克隆抗體tau-1和PHF-1分別由Binder和Greenberg提供。單克隆抗體SMI-31，SMI-33和SMI-34從Sternberg單克隆公司購(gòu)買(mǎi)。堿性磷酸酶標(biāo)記的抗鼠和抗兔IgG從Sigma公司購(gòu)買(mǎi)。
二、tau蛋白樣品的制備
PHFII-tau蛋白制備參照Iqbal等［7］的長(zhǎng)程序從AD患者腦中制備。其簡(jiǎn)要步驟如下：將AD大腦皮質(zhì)去腦膜及白質(zhì)后制備勻漿，再用不同孔徑尼龍膜進(jìn)行篩分，在2%SDS溶液中加熱和超聲破碎，不連續(xù)蔗糖密度梯度離心和玻璃珠層析。巴黎-奧利機(jī)場(chǎng)tau的制備參閱Kopke等［1］法。
三、去磷酸化反應(yīng)
除特別標(biāo)明外，去磷酸化反應(yīng)均在進(jìn)行45分鐘。反應(yīng)混合液中含50mmol/LTris-HCl(pH7.0)，20mmol/Lβ-2-巰基乙醇，0.1g/L牛血清蛋白，1.0mmol/LMnCl2;各0.01g/L抑肽酶(aprotinin)，Leupeptin和胃酶抑素(pepstatin)，0.07g/LPHF-Ⅱ-tau，2U/mlpp2A或5U/mlPP-2B(1單位PP-2A或PP-2B分別指在30℃，每分鐘催化磷酸化酶a或磷酸化酶激酶釋放1.0nmol磷酸的酶量)。在用PP-2B進(jìn)行的去磷酸化反應(yīng)液中，還含有1mmol/LCaCl2和1μmol/L鈣調(diào)素。ADP-tau的去磷酸化反應(yīng)條件除用較低的磷酸酶濃度外，其余同PHFII-tau的去磷酸化條件。去磷酸化位點(diǎn)的檢測(cè)用免疫印跡法。
四、免疫印跡法
經(jīng)去磷酸化處理的樣品先用4倍體積預(yù)冷丙進(jìn)行沉淀，再溶于SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)樣品緩沖液，煮沸5分鐘后進(jìn)行。所用一級(jí)抗體的稀釋倍數(shù)及特性見(jiàn)附表。印跡樣品用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗鼠或抗兔IgG作為第二抗體，以5-溴-4-氯-3吲哚磷酸-對(duì)氨基甲苯鹽(BCIP)和對(duì)硝基藍(lán)四唑氯(NBT)作為底物進(jìn)行顯色分析。
結(jié)果
一、pp2A和PP-2B可在多部位使PHFII-tau去磷酸化
PP-2A(2U/ml)和PP-2B(5U/ml)可使PHFII-tau的tau-1表位顯色，PP-2A和PP-2B還分別使PHFII-tau的Ser-46和Ser-235去磷酸化。兩種酶均使
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參考鏈接
1、http://www.helixnet.cn/archiver/tid-2721HTML
2、http://scitech.people.com.cn/GB/other2137/
3、http://book.新浪com.cn/nzt/spi/gongzuodna/
參考資料 >