逆流色譜法（CCC）是一種基于樣品在兩種互不混溶的溶劑之間的分配作用的全液體色譜方法。這種方法不需要固態支撐體，而是利用溶質在兩相溶劑中的分配系數差異來進行分離。根據其發展歷程，可分為液滴逆流色譜（DCCC）、離心液滴逆流色譜（CPC）和高速逆流色譜（HSCCC），其中高速逆流色譜（HSCCC）因其高效的分離能力和速度而在實際應用中最為普遍。
原理
逆流色譜法的原理是基于樣品在兩種互不混溶的溶劑之間的分配作用，溶質中各組分在通過兩溶劑相的過程中因分配系數不同而得以分離。這是一種不用固態支撐體的全液體色譜方法。
發展歷程
液滴逆流色譜（DCCC）
液滴逆流色譜是在逆流分溶法基礎上創建的色譜裝置，可使流動相呈液滴形式在固定相間交換，促使溶質中各組分在兩相之間進行分配，達到分離效果。然而，該法的缺點是流動相流速低，每小時只有十幾毫升；分離過程長，通常需要幾十小時才能完成一次幾個組分的分離。
離心液滴逆流色譜（CPC）
離心液滴逆流色譜，也稱為離心行星色譜，采用了離心技術來加速重力分離。這套實用的儀器包含數千條直管，能夠提供數百個理論塔板數的效能。盡管如此，CPC仍然面臨與DCCC類似的挑戰，包括低流速和離心速度的限制，以及在流動相進出口處使用的旋轉流體密封件性能不佳、價格昂貴且易損。
高速逆流色譜（HSCCC）
高速逆流色譜（HSCCC）是一種無需任何同態載體的液-液色譜技術，其原理是基于組分在旋轉螺旋管內的相對移動而互不混溶的兩相溶劑間分布不同而獲得分離。HSCCC的分離效率和速度可以與高效液相色譜（HPLC）相媲美。
HSCCC發展歷史
高速逆流色譜技術最早由美國國立衛生研究院的一位教授在1982年研究和發展起來。這項技術克服了固相載體帶來的樣品吸附、損失、污染和峰形拖尾等缺點，具有進樣量大、無不可逆吸附等優點，已被廣泛應用于醫藥、環境、化工等領域。
HSCCC原理詳解
HSCCC原理
高速逆流色譜分離原理結合了液液萃取和分配色譜的優點，是一種不需任何固態載體或支撐的液-液分配色譜技術。其基本分離原理是利用物質在兩相間分配系數的差別進行分配。HSCCC將兩溶劑的分配體系置于高速旋轉的螺旋管內，螺旋管的運動形式是在自身自轉的基礎上，同時繞一公轉軸旋轉，形成行星運動。這種運動形式所產生的離心力場不斷變化，使兩相溶劑充分混合和分配，從而達到洗脫分離的目的。由于樣品中各組分在兩相中分配系數不同，導致組分在螺旋柱中的移動速度不同，從而使樣品組分按分配系數的大小次序被依次洗脫出來。
固定相的保留
在高速逆流色譜儀的設計中，有兩個軸，一個是公轉軸，另一個是自轉軸，兩者由一個電動機驅動。儀器的公轉軸呈水平方向，圓柱形的螺旋管支持件圍繞此軸進行行星式運轉，同時圍繞自轉軸進行自轉。由于螺旋管柱的行星式運動產生了一個在強度和方向上變化的離心力場，使在螺旋柱中互不相溶的兩相不斷混合從而達到穩定的流體動力學平衡，兩相分離成兩層，重相占據螺旋管的每一段的外部，輕相占據每一段的內部，并且兩相沿螺旋管形成一個清晰的線性界面。因此，可以選擇合適的模式，使其中一相作為固定相保留在螺旋管中，另一相作為流動相并帶著樣品進入螺旋柱并不斷反復穿過固定相。這個過程頻率極高，當柱心以800r/min旋轉時，頻率超過每秒13次。流動相從固定相流動的相反方向泵入，以阻止固定相的運動，使固定相保留在色譜柱內，高速逆流色譜法就是利用了這種現象來實現高速分離的。
溶劑系統
溶劑體系的要求及分類
HSCCC是利用溶質在不同溶劑中的分配系數不同進行分離的，因此溶劑系統的選擇至關重要。對于分離的溶劑體系，應該滿足以下幾方面的要求：1) 不造成樣品的分解與變性，且不與之發生反應；2) 對樣品有足夠高的溶解度；3) 樣品在溶劑體系中有合適的分配系數值（K應在0.5-2之間）；4) 溶劑體系的各組分應分成體積比例適合的兩相，以免浪費溶劑；5) 固定相能實現足夠高的保留，且要滿足一定的要求（保留值越大峰形越好）。常見的溶劑體系按極性分類有以下幾種：1) 強極性溶劑體系；2) 中等極性溶劑體系；3) 弱極性溶劑體系；4) 極弱極性體系（碘化鈉體系）；5）加酸體系等。這些溶劑體系分別可以用于分離相應性質的天然產物。
溶劑體系選擇及組分分配系數的測定
選取一個合適的溶劑體系需要經過以下步驟：1) 通過TLC或者HPLC預測被分離物質的極性；2) 根據極性選擇合適的分離體系；3) 如果得知與被分離物質極性相似物質的分離體系，可以借鑒。在選擇溶劑系統時，需要測定組分的分配系數，而分配系數測定常采用高效液相色譜法或薄層色譜法，這兩種方法都能夠較準確地測出特定組分的分配系數值。HPLC法是將適量的樣品分別溶于已平衡的兩相溶劑，待分配平衡后，進行HPLC的測定，通過得到的色譜峰面積可精確計算出樣品在兩相間的分配系數。薄層色譜法則利用樣品在等體積上下相中分配平衡后用薄層色譜展開，通過薄層色譜得到的斑點判斷組分的分配情況。不同的體系，有著不同的平衡時間（不同溶劑系統中，從兩相溶劑系統的上相與下相溶劑混合時，直到兩相系統達到完全分層的時間），其影響著系統的分離效能，與固定相的保留率密切相關。
實驗操作及影響因素
實驗操作
在進行分離純化時，首先將固定相充滿于色譜柱，而后色譜柱即圍繞自身軸進行自轉；同時圍繞設備中心軸進行高速公轉（即行星式運動），再將流動相泵入色譜柱。在此之前，首先選擇預先平衡好的兩相溶劑中的一相為固定相，并將其充滿螺旋管柱，然后使螺旋管柱在一定的轉速下高速旋轉，同時以一定的流速將流動相泵入柱內。在體系達到流體動力學平衡后（即開始有流動相流出時），將待分離的樣品注入體系。進樣時，將樣品組分溶于一定體積的的流動相之中，其組分將依據其在兩相中分配系數的不同實現分離。同時，在注入固定相和流動相前，需配制溶劑系統，充分振蕩后靜置過夜；分離上下層溶劑，超聲排氣30分鐘。而測試結束后用氮氣將固定相推出，可測得保留率，有時由于固定相的流失導致流出液乳化，一般要求固定相的保留值大于50%。
影響因素
由于高速逆流色譜是無需任何固態載體支撐的液-液色譜，其中作為固定相的液體在色譜柱中的保留程度對于高速逆流色譜的分離過程是十分重要的。首先，所選擇的溶劑體系對固定相保留率有很大的影響，如兩相密度差、粘度、界面張力等。兩相的密度差對固定相保留率的影響最大，固定相保留率和密度差基本呈線性關系。其次，還存在一些人為可以操控的條件會對固定相保留率產生影響，如高速逆流色譜的轉速、流速、以及柱溫等。其中，螺旋管柱的轉速以及它產生的離心力場對兩相的混合程度具有決定性的影響。因此，對于界面張力較高的溶劑系統，應使用較高的轉速，以使兩相之間能夠劇烈的混合，從而促進分配和減少質點傳遞的阻力。對于界面張力較低的溶劑系統，應使用較低的轉速，以避免過分混合引起乳化作用，以及固定相的流失。在流動相流速方面，固定相保留率與流速平方根之間有著線性關系。流動相流速快不利于固定相的保留，且出峰時間太快會導致峰與峰間的分離度較差，而低流速雖然可以滿足提高固相保留率的要求，但是分離時洗脫時間太長，且峰形變寬、耗費大量的流動相，故選擇合適的流速對整個分離體系非常重要。儀器的柱溫對固定相的保留同樣也有著不可忽視的作用，其溫度對于親水性強的正丁醇溶劑體系的固定相保留率影響較大。同時溫度升高能改變溶劑的粘度，進而影響兩相的分層時間。在選定了溶劑體系后，有時需要對三個儀器運行參數（轉速，流動相流速，進樣體積）進行正交試驗，以確定最佳分離條件。分離是一種較為復雜的動態高速分配過程，其分離效率不僅和溶劑系統有關，還受分離溫度、螺旋管轉速、流動相流速、梯度洗脫模式及進樣量、進樣方式等因素的影響。
應用
高速逆流色譜技術主要應用于天然藥用植物活性成分的分離、標準品的制備、快速分離和重要指紋圖譜分析以及天然新藥的研發和篩選。
參考資料 >
逆流色譜法.wenku.2024-11-01
逆流色譜原理簡介.逆流色譜原理簡介.2024-11-01
逆流色譜的原理和發展.逆流色譜的原理和發展.2024-11-01