多肽合成是一個重復添加氨基酸的過程，合成方向從C端（羧基端）向N端（氨基端）進行；從1963年Merrifield發(fā)展成功了固相多肽合成方法以來，現(xiàn)在大多采用固相合成，從而大大的降低了每步產(chǎn)品提純的難度；為了防止副反應的發(fā)生，合成柱和添加的氨基酸的側(cè)鏈都是預先被保護，只有羧基端處于游離，并且在反應之前必須先用化學試劑活化它。固相合成方法有兩種，即Fmoc和tBoc，由于Fmoc比tBoc存在很多優(yōu)勢，現(xiàn)在大多采用Fmoc法合成，但對于某些短肽，tBoc因其產(chǎn)率高的優(yōu)勢仍然被很多企業(yè)所采用；多肽合成的過程需要操作人員直觀監(jiān)測，同時合成后可進行在線切割（切割試劑TFA的強腐蝕性對反應器材質(zhì)有了極大限制），這些要求限制反應器以玻璃材質(zhì)最為適用。具有特定順序的合成多肽，不能采用任意聚合的方法，只能采用逐步縮合的定向多肽合成方法，先將不需要反應的氨基或羧基用適當?shù)幕鶊F暫時保護起來，然后再進行連接反應，以保證多肽合成的定向進行。
多肽的定義
多肽是一種與生物體內(nèi)各種細胞功能都相關(guān)的生物活性物質(zhì)，它的分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間，是由多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結(jié)合而成的化合物。多肽是涉及生物體內(nèi)各種細胞功能的生物活性物質(zhì)的總稱，常常被應用于功能分析、抗體研究、尤其是藥物研發(fā)等領(lǐng)域。
多肽合成技術(shù)
1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法(SPPS)，由于其合成方便，迅速，成為多肽合成的首選方法，而且?guī)砹硕嚯挠袡C合成上的一次革命，并成為了一支獨立的學科——固相有機合成，固相合成的發(fā)明同時促進了肽合成的自動化。世界上第一臺真正意義上的多肽合成儀出現(xiàn)在1980年代初期。
液相合成
基于將單個N-α保護氨基酸反復加到生長的氨基成份上，合成一步步地進行，通常從合成鏈的C端氨基酸開始，接著的單個氨基酸的連接通過用DCC，混合炭酐，或N-carboxy酐方法實現(xiàn)。Carbodiimide方法包括用DCC做連接劑連接N-和C-保護氨基酸。重要的是，這種連接試劑促接N保護氨基酸自己炭基和C保護氨基酸自由氨基間的縮水，形成肽鏈，同時產(chǎn)出N，N?/FONT>-dyaylcohercylurea副產(chǎn)物。然而，此方法因其導致消旋的副反應，或在強堿存在時形成5(4H)-oxaylones和N-acylurea而受到影響。慶幸地是，這些副反應能最小化，但是還不能完全消除。方法是加入象HoSu或HoBT這樣的連接催化劑，此外，此方法也可用于合成N保護氨基酸的活性衍生物。依次產(chǎn)生的活性酯將自發(fā)與任何別的C保護氨基酸或肽反應形成新的肽
多肽合成儀的種類
多肽合成儀是指用來合成多肽的儀器，因為多肽合成的步驟很繁瑣，又很耗時，多家公司開發(fā)了自動多肽合成儀。一般分為兩類，一類是針對數(shù)量少但合成量大的生產(chǎn)型應用，典型代表是美國ABI公司的ABI336型多肽合成儀，其反應器轉(zhuǎn)動方式有別于前兩代的多肽合成儀，即反應器上方相對固定，而下方作圓周360度快速旋轉(zhuǎn)，帶動反應器里的固液兩相從底部向上作螺旋運動，一直達到反應器的最上方；另外一類多肽合成儀針對于藥物研發(fā)、基因研究等科研性應用，典型代表是德國Intavis AG公司的ResPep SL和MultiPep RS系列，可以同時提供固相合成和膜合成的應用，并能自動幫助客戶進行圖譜篩選同時完成高通量的多肽合成工作。
多肽合成儀的分類
多肽合成儀的問世大大促進了多肽科學的發(fā)展。反過來，隨著多肽科學的發(fā)展，科學家也對合成儀提出了更高的要求，從而帶動了合成儀的發(fā)展。目前多肽合成儀品種繁多，從合成量上分，可分為微克級的，毫克級的，克級的和公斤級的；從功能上分，可分為研究型的，小試型的，中試型的，普通生產(chǎn)型的和GMP生產(chǎn)型的；從自動化程度上分，可分為全自動的，半自動步槍的和手動的；從通道上分，可分為單通道的和多通道的；從技術(shù)角度上分，可分為第一代的，第二代的，和第三代的；等等。
第一代多肽合成儀 ]第一代多肽合成儀產(chǎn)生時間為上世紀六十年代末至七十年代初。b]代表產(chǎn)品是Beckman公司推出的Beckman 990 Peptide Synthesizer和Vega’s Biotechnologies公司推出的Vega’s 296 Peptide Synthesizer。如今該兩家公司均以放棄了多肽合成儀的研發(fā)與生產(chǎn)，我們只能在早期的學術(shù)文獻中找到其設計原理與研究情況。雖然隨著生產(chǎn)工藝的改進和發(fā)展，第一代多肽合成儀已全部退出了市場。但1990年以前的眾多肽化學文獻都是在此實驗設備上運行研發(fā)而來，第一代的多肽合成儀為之后的合成儀研發(fā)與制造產(chǎn)生了重大意義。第二代多肽合成儀 ]第二代多肽合成儀誕生在上世紀八十年代。b]代表產(chǎn)品是Protein Technologies公司推出的PS3 Peptide Synthesizer以及Advanced ChemTech公司推出的ACT peptide synthesizer Model 90。標志性特點是溫和反應法合成多肽，一般可分為單純氮氣鼓泡和搖動式兩種。PS3 的設計原理是采用氮氣鼓泡的反應方式來對反應物進行攪拌，即合成儀上反應器是固定的，氮氣從反應器的下方通過反應器到上部排出，在這一過程中產(chǎn)生的汽泡把固相和液相混合起來。這樣設計的好處是結(jié)構(gòu)簡單，成本低，但反應相對溫和：1）有時候多肽-固相載體在靜電作用下會“抱團”，使其不能與液相充分混合，在這種情況下需要調(diào)高氮氣的壓力以消除靜電作用；而在靜電作用消除后要把壓力立刻調(diào)低，不然的話較高的壓力會把多肽固相載體“吹”到反應器液面上方。由于多肽-固相載體具有較強的粘壁性，一旦被粘到反應器液面上方就再也無法下來，也就是無法再參加反應。顯然第一代機器是無法自動作這樣的壓力調(diào)整的，這就是造成反應“死角”的重要原因。反應死角會降低多肽合成的效率和多肽的純度，有的甚至造成合成的失敗。2）長時間氮氣鼓泡會使溶液揮發(fā)，液面降低后一部分多肽-固相載體就粘在液面上方，也無法再參加反應。3）氮氣消耗量大，運行成本增大。ACT90的設計原理是反應器在直立下圍繞原點作左右擺動，或者圓周運動。ACT的多肽合成儀同樣具有反應溫和的特點，即轉(zhuǎn)動角度與速度都不能夠完全達到氨基酸耦合的極限，反應往往需要更長的時間。第三代多肽合成儀 ]第三代多肽合成儀誕生在上世紀九十年代b] ]代表產(chǎn)品是美國b]Applied Biosystems公司的ABI 433 peptide synthesizer 、C S Bio公司的CS336無死角多肽合成儀和Peptide Scientific Inc公司生產(chǎn)的全系列180-270度度機械攪拌多肽合成儀。。ABI433的設計原理是反應器上方相對固定，而下方作圓周360度快速旋轉(zhuǎn)，帶動反應器里的固液兩相從底部向上作螺旋運動，一直達到反應器的最上方。換句話說，溶液可以達到反應器內(nèi)部的任意點，真正做到了無死角。由于攪拌速率可達每分鐘1800轉(zhuǎn)的高速，反應得以充分完全。由于無死角的攪拌方式保證的肽的合成純度，ABI433型多肽合成儀（其退出多肽合成儀市場后最后一款儀器）至今在世界上還占有著很大的比例。當然，ABI產(chǎn)品的售價也是最高的。由于部件使用頻率高，電磁閥會經(jīng)常損壞，而ABI將7個電磁閥做成模塊化的設計，壞掉一個電磁閥必須要更換整個模塊，無形中增加了維修成本。 CS336的設計原理是反應器中點為圓心，上下做180度旋轉(zhuǎn)攪拌，攪拌速度可達180rpm，同時其采用了氮氣鼓泡反應方式的優(yōu)越性，將氮氣吹動作為可選反應方式融入反應方法中，多肽合成儀在科研領(lǐng)域的高耦合率效果得到充分體現(xiàn)。第四代多肽合成儀由于180度無死角的攪拌模式得到了越來越多的客戶的認可，Peptide Scientific Inc公司從2002年開始將180度上下翻轉(zhuǎn)的機械無極調(diào)速攪拌模式作為其開發(fā)的全系列產(chǎn)品的標志性特征，從PSI200、300、400、500到600全系列多肽合成儀均采用180-270度上下翻轉(zhuǎn)的機械攪拌模式，PSI采用了數(shù)控馬達系統(tǒng)，攪拌速度無極可調(diào)，攪拌強度和速度在物理能量上發(fā)揮到了極致。第五代多肽合成儀美國CEM公司以蛋白質(zhì)有機反應設備的制造著稱，推出了微波多肽合成儀Liberty。其采用微波加熱方式，大大提高了反應速度，將反應的速率增加到之前多肽合成儀的幾倍甚至十幾倍。其與生俱來的特點得到了很多研發(fā)型客戶的認可。藥物篩選型多肽合成儀如ACT公司推出的106通道異步全自動多肽合成儀、AAPPTEC公司推出的96通道全自動多肽合成儀、PTI公司推出的98通道全自動多肽合成儀等。
運行原理
多肽合成儀以固相合成為反應原理，在密閉的防爆玻璃反應器中使氨基酸按照已知順序（序列，一般從C端-羧基端 向 N端-氨基端）不斷添加、反應、合成，操作最終得到多肽載體。固相合成法，大大的減輕了每步產(chǎn)品提純的難度。為了防止副反應的發(fā)生，參加反應的氨基酸的側(cè)鏈都是保護的。羧基端是游離的，并且在反應之前必須活化。固相合成方法有兩種，即Fmoc和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多優(yōu)勢，現(xiàn)在大多采用Fmoc法合成，但對于某些短肽，tBoc因其產(chǎn)率高的優(yōu)勢仍然被很多企業(yè)所采用。
具體合成由下列幾個循環(huán)組成：
1）去保護：Fmoc保護的柱子和單體必須用一種堿性溶劑（哌啶）去 除氨基的保護基團。
2）激活和交聯(lián)：下一個氨基酸的羧基被一種活化劑所活化。活化的單體與游離的氨基反應交聯(lián)，形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅(qū)使反應完成。循環(huán)：這兩步反應反復循環(huán)直到合成完成。
3）洗脫和脫保護：多肽從柱上洗脫下來，其保護基團被一種脫保護劑（TFA）洗脫和脫保護。
基本元件
反應器
數(shù)百年來，制藥業(yè)的反應器/反應釜 設備以玻璃材質(zhì)最為常見，因其完全透明且耐腐蝕，而被眾多化學、生物學專家沿用。多肽合成的過程需要操作人員直觀監(jiān)測，同時合成后可進行在線切割（切割試劑TFA的強腐蝕性對反應器材質(zhì)有了極大限制），這些要求限制反應器以玻璃材質(zhì)最為適用。
玻璃材質(zhì)的反應器在制造工藝上有極大的難度限制：①燒制工藝：磨口精度要求極高，正如很多國產(chǎn)設備都無法達到要求出現(xiàn)漏液漏氣現(xiàn)象，玻璃壁均勻程度等。②配合攪拌柄以及密封裝置的成套加工工藝③防爆處理
氨基酸儲罐
溶劑儲罐
量筒
轉(zhuǎn)液瓶
感應器
多端觸發(fā)器自感應定量量取法，直觀、科學、相對誤差最低。
廢液桶
廢液桶通常選擇容積較大的聚乙烯桶，保證通風良好，同時需安裝感應器裝置時刻檢測廢液情況，避免溢出。
控制配件
電磁閥
多肽合成儀中的電磁閥屬于敏感配件，其控制液路的串聯(lián)與閉路，在氨基酸轉(zhuǎn)移與量取，溶劑轉(zhuǎn)移與量取兩步驟中起到至關(guān)重要的作用。不同品牌的合成儀對電磁閥的設計與排布也略有不同。
控制面板內(nèi)往往含有光敏組建，部分控制電磁閥以及感應器控制組。與電腦主機的控制系統(tǒng)、合成儀統(tǒng)一的鏈接在一起，完成多肽合成的全過程。
軟件系統(tǒng)
多肽合成儀的操作軟件。不同品牌合成儀所注冊的軟件也不同。
檢測方法
UV Monitor
在多肽合成儀中，在線檢測耦合效果的裝置，如UV Monitor往往是選配裝置，客戶可根據(jù)實驗的需要選購。其功能是讓操作者直觀的看到多肽合成的每一部氨基酸偶聯(lián)效果，從而針對特定的序列做合成設置的調(diào)整，最終達到最佳合成效果。
對于不熟悉多肽合成儀操作的用戶來說，UV Monitor是相當重要的。
試劑檢測：沒有選購在線檢測附件的多肽合成儀用戶，也可以采用試劑檢測方法做基本的耦合效果測定實驗。
固相多肽合成中，主要是通過檢測樹脂上游離氨基來判斷連接效率，檢測方法稱為Kaiser方法，其檢測結(jié)果，如果有游離氨基的時候，顯示藍色，或紅褐色（pro，ser，His）。
Kaiser試劑包括：A，6%茚三酮的乙醇溶液；B，80%苯酚的乙醇溶液；C，2% 0.001M 氰化鉀的吡啶溶液。
配制中的吡需要經(jīng)過三處理后，重蒸后再使用。檢測過程，取少量樹脂，加入A，B，C各2-3滴，100℃下加熱1-2min，如果溶液有蘭色，或樹脂出現(xiàn)蘭色，紅褐色，表明還有游離氨基，否則說明連接完全。
其它檢測游離氨基的方法：三硝基苯磺酸法，三硝基苯酚法，溴芬蘭法等。
參考資料 >
多肽合成的工作原理.安諾倫(北京)生物科技有限公司.2024-04-02
關(guān)于多肽合成.微信公眾平臺.2024-04-02
多肽合成方法(不銹鋼分子蒸餾儀).百家號.2024-04-02
多肽合成的基本原理.tianjibio.com.2024-04-02