DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole），是一種能夠與脫氧核糖核酸強力結(jié)合的熒光染料，常用于熒光顯微鏡觀測。因為DAPI可以透過完整的細胞膜，它可以用于活細胞和固定細胞的染色。DAPI能快速進入活細胞中與DNA結(jié)合，因此DAPI對生物體而言，也被視為一種毒性物質(zhì)與致癌物，使用過程中應注意操作與拋棄的處理程序。
介紹
在熒光顯微鏡觀察下，DAPI染料是利用紫外光波長的光線激發(fā)。當DAPI與雙股DNA結(jié)合時，最大吸收波長為358nm，最大發(fā)射波長為461nm，其發(fā)散光的波長范圍含蓋了藍色至青綠色。DAPI也可以和核糖核酸結(jié)合，但產(chǎn)生的熒光強度不及與脫氧核糖核酸結(jié)合的結(jié)果，其發(fā)散光的波長范圍約在500nm左右。
DAPI的發(fā)散光為藍色，且DAPI和綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)或Texas 紅色染劑(紅色熒光染劑)的發(fā)散波長，僅有少部分重疊，研究員可以善用這項特性在單一的樣品上進行多重熒光染色。
DAPI
中文名：4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲(?)
英文名：4',6-diamidino-2-phenylindole，2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine，DAPI dihydrochloride
CAS number：28718-90-3
光譜性質(zhì)： DAPI的最大激發(fā)波長為340nm，最大發(fā)射波長為488nm
與雙鏈脫氧核糖核酸結(jié)合時最大吸收/最大發(fā)射為358 nm/461 nm；與核糖核酸結(jié)合時，最大發(fā)射移動到400 nm左右。
染色原理
染色原理：
DAPI 為一種熒光染料，可以穿透細胞膜與細胞核中的雙鏈DNA結(jié)合而發(fā)揮標記的作用，可以產(chǎn)生比DAPI自身強20多倍的熒光，和EB相比，對雙鏈DNA的染色靈敏度要高很多倍。顯微鏡下可以看到顯藍色熒光的細胞，熒光顯微鏡觀察細胞標記的效率高(幾乎為100 %) ，且對活細胞無毒副作用。DAPI染色常用于細胞凋亡檢測，染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀檢測。DAPI也常用于普通的細胞核染色以及某些特定情況下的雙鏈脫氧核糖核酸染色。細胞經(jīng)熱激處理后用DAPI染色3分鐘，在熒光顯微鏡下可以看到到細胞核的形態(tài)變化。
a、正常的煙草細胞核：核形完整，染色質(zhì)均勻。
b、染色質(zhì)固縮，向外周聚集，形成周邊化。
c、染色質(zhì)進一步固縮，形成很多顆粒物質(zhì)。
d、細胞核破裂形成碎片，核解體。
染色步驟
在細胞移植前，將DAPI 以一定的濃度加入培養(yǎng)基中，與細胞共同孵育過夜，用PBS 緩沖液漂洗至少6 次以洗掉未結(jié)合的DAPI，在用酶消化后離心收集細胞，加入DMEM 培養(yǎng)基制成細胞懸液以備用。
存儲條件：-20℃避光保存
每次使用，用量較少，可反復凍融，無需分裝
注意事項：
1、DAPI強烈致癌，操作時要戴上手套。
2、貯存液用70%乙醇配制，濃度100 μg/ml，可用黑紙包住，長期凍存。使用液按1:1000用pbs稀釋，最終濃度100 ng/ml。
3、DAPI是非常優(yōu)秀的脫氧核糖核酸染料，固定過和沒有固定過的活細胞均可用DAPI染色。
歷史
1971年DAPI在一項關(guān)于制抗非洲錐蟲病的藥物的研究中第一次被合成于OttoDann的實驗室。它雖然不是一種成功的藥物，但更深入的研究表明它與DNA強力結(jié)合并在此時發(fā)出更強的熒光，這導致了1975年它被用在超速離心分析法中以標記線粒體DNA。與DNA結(jié)合時激發(fā)的強熒光使它被廣泛用于熒光顯微鏡技術(shù)中對DNA的染色。上世紀70年代末證實DAPI可以被用來在植物，微生物，多細胞動物和細菌細胞中追蹤脫氧核糖核酸，1977年證實它可以被用來定量給細胞中的DNA染色，同時也證實DAPI可在流式細胞術(shù)中用作DNA染料。
熒光屬性
當DAPI與雙股DNA結(jié)合時,在熒光顯微鏡觀察下，DAPI染劑在358nm(紫外線)處有一個最大吸收峰，并在461nm(藍)處有一個最大發(fā)射峰，其發(fā)射光的波長范圍含蓋了藍色至青綠色，因此在熒光顯微技術(shù)中DAPI被紫外線照亮且被藍或青色濾鏡檢出。DAPI也可以和核糖核酸結(jié)合，但產(chǎn)生的熒光強度不及與脫氧核糖核酸結(jié)合的結(jié)果，其發(fā)射光的波長范圍約在400nm左右。
活細胞毒性
DAPI可用于固定細胞染色，但是因為活細胞染色對DAPI濃度有嚴格要求，它很少被用于活細胞染色。DAPI能快速進入活細胞中與DNA結(jié)合，因此DAPI對生物體而言，也被視為一種毒性物質(zhì)與致癌物。然而在MSDS中它被標記為無毒。盡管DAPI沒有顯現(xiàn)出對E.coli的誘變性，它在機器制造商提供的信息上被認為是一種DNA誘變劑。由于DAPI可以摻入脫氧核糖核酸螺旋中，它很有可能有底層的DNA誘變性，因此應小心配置和使用DAPI。
替代
類似于DAPI技術(shù)，赫斯特染色是一種既可以用于活細胞也可以用于固定細胞的藍色熒光染料，并且可以使用與DAPI相同的機器濾鏡設置。
參考資料 >